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三聚氰胺门之蛋白检测技术大比拼
【字体: 大 中 小 】 时间:2008年10月31日 来源:网络来源
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三聚氰胺门之蛋白检测技术大比拼
从消化的角度来看,动物蛋白质比植物蛋白质更易消化和吸收。从蛋白质的氨基酸的组成种类上来看,人体蛋白质由20种氨基酸组成,其中12种氨基酸是人体可以通过自身生化反应合成的,被称为非必需氨基酸;还有8种氨基酸人体不能合成,必须从食物中摄取,被称为必需氨基酸。动物蛋白中,一般都含有人体必需的8种氨基酸,特别是蛋制品和乳制品,故一般来说动物蛋白营养价值比植物蛋白高。
正因为蛋白质有着如此重要的重要性及营养价值,蛋白质含量才成为食品检测中的重要指标。目前蛋白质含量检测的国标规定方法是凯氏定氮法。
凯氏定氮法原理:由于蛋白质是含氮的有机化合物,蛋白质平均含氮量约16%,经典的凯氏定氮法检测的原理其实是检测食品中氮的总含量。其基本过程是将食品与硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分解,分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量乘以换算系数,即为蛋白质含量。
从凯氏定氮法原理不难看出这种方法检测的是食品总氮的含量,如果认为加入含氮(或氨基)的化学品,这种方法是无法区别的,将化学品中含氮量直接折算成了蛋白质含量,从而达到了人为提高蛋白质含量目的。
目前为止已经被曝光的用于牛奶或其他食品掺假的化学品有:
甘氨酸 C2H5NO2,含氮量18.7%
尿素,CO(NH2)2,含氮量46%
三聚氰胺,分子式C3N3(NH2)3,含氮量66%。
凯氏定氮法是无法区别此类富含氮的化合物,那么有没有别的蛋白质定量方法可以识别此类“假蛋白”,准确测量食品中的蛋白质含量呢?
目前常用的蛋白质定量方法除凯氏定氮法外还有有以下五种:
紫外吸收法:
蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。
优点:简便、灵敏、快速。对低浓度的盐,如 (NH4)2SO4等及和大多数缓冲液有一定的抗干扰能力。
缺点:测定准确度较差,干扰物质多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰。由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化,故测定样品时的要统一pH值。
双缩脲法(Biuret法):
双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。
干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。
Folin-酚试剂法(Lowry法):以最早期的双缩脲法为基础,并有所改进。蛋白质与Cu2 反应,产生蓝色的反应物。但是与双缩脲法相比,Lowry 法敏感性更高。缺点是需要顺序加入几种不同的反应试剂;反应需要的时间较长;容易受到非蛋白物质的影响;含EDTA,Triton x-100,(NH4)2SO4等物质的蛋白不适合此种方法。
考马斯亮蓝法(Bradford 法):这种方法的原理是蛋白质与考马斯亮兰结合反应,产生的有色化合物吸收峰595nm。其最大的特点是,敏感度好,是Lowry 和BCA 两种测试方法的2 倍;操作更简单,速度更快;只需要一种反应试剂;化合物可以稳定1小时,方便结果;而且与一系列干扰Lowry,BCA 反应的还原剂(如DTT,巯基乙醇)相容。但是对于去污剂依然是敏感的。
缺点:使用不同蛋白质的标准品会导致同一蛋白样品的定量结果差异较大。
BCA(Bicinchoninine acid assay)法:这是一种较新的、更敏感的蛋白测试法。要分析的蛋白在碱性溶液里与Cu2 反应产生Cu ,后者与BCA形成螯合物,形成紫色化合物,吸收峰在562nm波长。此化合物与蛋白浓度的线性关系极强,反应后形成的化合物非常稳定。相对于Lowry法,操作简单,敏感度高。但是与Lowry法相似的是容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。
BCA法示意图
各种蛋白质测定方法比较如下:
方法 |
灵敏度 |
时间 |
原理 |
干扰物质 |
说明 |
紫外吸收法 |
50~100mg, |
快速 5~10分钟 |
蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收 |
各种嘌吟和嘧啶;各种核苷酸 |
测定准确度较差,干扰物质较多 |
双缩脲法(Biuret法) |
1~20mg |
中速 20~30分钟 |
多肽键+碱性Cu2+紫色络合物 |
铵盐;Tris缓冲液: 某些氨基酸 |
用于快速测定,但不太灵敏;不同蛋白质显色相似 |
凯氏定氮法(Kjedahl法) |
1~5mg, |
费时 8~10小时 |
将蛋白氮转化为氨,用酸吸收后滴定 |
各种铵盐 |
用于标准蛋白质含量的准确测定;无法区别含氮化合物干扰;费时长 |
Folin-酚试剂法,, , (Lowry法) |
~5mg |
慢速 40~60分钟 |
双缩脲反应;磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原 |
铵盐;Tris缓冲液;甘氨酸;各种硫醇 |
耗费时间长;操作要严格计时;颜色深浅随不同蛋白质变化; 标准曲线不是严格的直线形式,且专一性差 |
考马斯亮蓝法(Bradford法) |
1~5mg, |
快速 5~15分钟 |
考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时,其lmax由465nm变为595nm |
强碱性缓冲液;TritonX-100; SDS |
较好的方法;干扰物质少;颜色稳定; 颜色深浅随不同蛋白质变化; 标准曲线有轻微的非线性 |
BCA法 |
普通BCA为 20~200mg, 微量BCA为 0.5~10mg |
较快速 40分钟内 |
在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+ |
螯合剂;略高浓度的还原剂 |
抗干扰能力强, |
使用化工原料搀入食品以达到提高蛋白质含量的作假手段,很大程度上是针对某种特定的检测手段如凯氏定氮法。只要明确了一种分析手段,就会找到相应的干扰物质用于提高蛋白质含量的检测值。
因此,在复杂混合物蛋白质含量检测上,应该首先通过实验验证,确定几个可用的检测手段,在实际应用中,做到几个检测手段联合应用,相互参照,将大大提高蛋白质测定的准确性。
最近几年,媒体还曝光过使用植物蛋白替代动物蛋白,还有的添加人工蛋白:即用各种来源的水解蛋白代替食品中的天然蛋白质。这种用其他蛋白质替代天然蛋白,提高产品蛋白质含量的的方法,单纯采用上述蛋白质含量检测手段是很难区分的。从营养学的角度讲,在食品中添加其他蛋白质以改善食品的营养价值,是可取而且应该鼓励的。但这种改善必须有严格的科学依据,而不是单纯提高总蛋白质含量的检测值以达到某些食品标准的要求。
在进行目标蛋白质分析的时候,一般采用HPLC或电泳方法将不同的蛋白质分离开来,并进一步确定目标蛋白质的含量。将为了区分食品中是否添加了非标称来源的蛋白质,从技术角度讲,可以通过类似的方法建立指纹图谱进行区分。不同来源的蛋白质种类与含量不同,通过确定主要蛋白质的存在与含量及相互之间的比例,可以确定这些蛋白质的来源。蛋白质混合物可以通过HPLC, MS, 2D等手段进行分离,从而进一步分析其主要组分的含量与相互之间的比例,从而建立某种食品如奶制品中的主要蛋白质成分指标。
如果说这些分析手段存在较大的技术困难,还有一种比较简单的方法来大概的确定其成分。我们知道,人食用蛋白质后,这些蛋白质经过消化最终变成氨基酸进入人体(未经消化的蛋白质直接吸收的可能性非常小,据信这也是蛋白质过敏的主要原因)。因此蛋白质的营养价值其本质上是其组成氨基酸的营养价值。而不同来源的蛋白质氨基酸比例与含量会有差异,通过将蛋白质彻底水解,并分析这些氨基酸的组成与相互之间的比例,可以区分牛奶中是否添加了其他来源的蛋白质。如果真的有人作假手段高明到氨基酸组成与天然来源的一致,单就蛋白质的营养价值上来说,也可以具有与天然产品具有类似的营养价值了。
综合来说,任何存在的检测手段都可能有相应的干扰手段来作弊,但通过建立相对完备的检测手段,可以增加作弊的难度并提高作弊的成本,当作弊成本超过其收益的时候,也就没有人作弊了。