“赛默飞世尔特约之2010实验室创新技术大奖”评选活动开展以来，生物通已经陆陆续续收到不少项目，这些项目中有的能减少实验步骤，有的能降低实验成本，还有一些改进了实验设备，让我们的实验过程更加轻松。

目前生物通已经公布了一些项目，这些项目也倍受读者的关注。为了感谢这些分享实验技巧的参选者，生物通将于2010年7月10日从在此之前投稿的参选者中抽出三名，送出世博会门票或等值的礼品。

这一次，宝船生物医药科技有限公司的赵玉莲与我们分享了一些富有挑战性片段的克隆。

参选项目：GC含量高的片段或者超长片段的克隆

背景：一般的连接反应是指利用经过限制性内切酶消化的线形载体与目的基因两端暴露出的平末端或相同的粘性末端，使用T4 DNA 聚合酶将二者连接起来形成重组载体。但是有时PCR难以扩增高GC含量或者大片段的插入片段。

方法改进：我们可以把一个长片段或者GC含量高的插入片段设计成几个有重叠部分（大约20-30bp）的片段如F1,F1,F3等，然后通过PCR扩增，片段需要酶切处理按比例F1:F2:F3:linear Vector= n1:n2:n3:n4 （参考 insert:vector=(9-3):1)连接到载体中去。我们叫这种方法为 muti-ligation 。

具体说来是把长片段或者GC含量高的片段分成F1,F2,F3等（中间有15-30bp的重复序列），设计引物和合适的酶切位点，PCR分别扩增出F1，F2,F3等。然后纯化PCR产物F1-3等并酶切，把载体用对应的合适酶切位点酶切，然后把酶切过的片段F1-3等和线性化的载体16度连接过夜，比例按F1:F2:F3:linear Vector= n1:n2:n3:n4 （参考 insert:vector=(9:1)然后转化到感受态细胞，第二天挑阳性克隆。如果你为了更保险，可以用连接子当模板 做PCR来扩增全长 然后再连接到载体上。

结果：经过几个实验的验证，此方法很有效。

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