生物通报道 麻省理工学院的研究人员利用新一代测序仪，开发出一种名为HiTS-FLIP的新技术，能以前所未有的深度对DNA-蛋白的结合亲和力进行定量测定。

新一代测序技术自问世以来，为生物学带来了深刻的变化。它极大地推动了非模式物种的全基因组测序工作，越来越多的物种基因组信息相继公布。同时，通过基因组重测序，人们可以了解到单核苷酸多态性、突变热点、基因组结构变异、群体多态性等重要信息。此外，新一代测序还广泛应用在宏基因组、转录组和表观基因组研究。然而，它的应用可不可以再广一些呢？

麻省理工学院（MIT）的Christopher Burge及其同事也在思考这一问题。几年前，MIT购入了Illumina的测序仪。该仪器有着很好的微流体学和高端的照明及成像系统。于是，他们打算用它来试着研究DNA与蛋白质的相互作用。

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他们的想法是，将荧光标记的蛋白直接放入流动槽。如果这种荧光标签与测序所使用的一种荧光dNTP匹配，那么你可以让仪器对它成像，就好像对另一个碱基成像，你也可以看到蛋白所结合的DNA簇，并根据信号强度判断结合有多强。他们开发出的这种技术称为高通量测序-荧光配体相互作用图谱分析（HiTS-FLIP）。

研究小组将HiTS-FLIP技术应用到酵母转录激活因子Gcn4上。首先，研究人员制备了一个随机25聚体的DNA文库，将其放入仪器，并开展测序步骤。之后他们通过变性，剥离了非天然链，利用新的引物和Klenow合成了新的DNA。他们再加入与单体(m)Orange结合的GCN4，并对结合的蛋白成像。最后，他们在簇测序图像上叠加了蛋白结合荧光图像。簇大小的强度校正让他们能够预测特定序列的内在亲和力。之后，他们还与Illumina的研究小组合作，从数据中获得了解离常数。这是很多测定相互作用的方法无法实现的。

除了能够测定解离常数，此方法还有其他优点。由于流动槽表面的低背景，成像前的洗涤步骤可限制在2分钟。相比之下，蛋白结合芯片需要20分钟的洗涤步骤，才能去除许多弱的结合相互作用。

同时，测量深度也有很大提高。在25聚体的背景下，他们获得了每个7聚体的蛋白结合亲和力的10万次测定以及每个12聚体的500次测定。它所实现的分析深度能够让研究人员了解不同位置上残基之间的复杂相互依存关系。通过捕获弱及复杂的相互作用，该数据有助于GCN4结合的预测，并揭示出有着不同表达动力学的GCN4调控启动子。

这些数据显示motif位置之间存在复杂的相互依存，能够更好地区分体内Gcn4p结合位点和调控靶点，并显示与Gcn4p有着不同的启动子亲和力的基因有着不同的功能和表达动力学。（生物通 薄荷）

原文摘要

Direct measurement of DNA affinity landscapes on a high-throughput sequencing instrument

Nature Biotechnology 29, 659–664 (2011) doi:10.1038/nbt.1882

摘要

Several methods for characterizing DNA-protein interactions are available1, 2, 3, 4, 5, 6, but none have demonstrated both high throughput and quantitative measurement of affinity. Here we describe 'high-throughput sequencing'-'fluorescent ligand interaction profiling' (HiTS-FLIP), a technique for measuring quantitative protein-DNA binding affinity at unprecedented depth. In this approach, the optics built into a high-throughput sequencer are used to visualize in vitro binding of a protein to sequenced DNA in a flow cell. Application of HiTS-FLIP to the protein Gcn4 (Gcn4p), the master regulator of the yeast amino acid starvation response7, yielded ~440 million binding measurements, enabling determination of dissociation constants for all 12-mer sequences having submicromolar affinity. These data revealed a complex interdependency between motif positions, allowed improved discrimination of in vivo Gcn4p binding sites and regulatory targets relative to previous methods and showed that sets of genes with different promoter affinities to Gcn4p have distinct functions and expression kinetics. Broad application of this approach should increase understanding of the interactions that drive transcription.