生物通报道：来自斯坦福大学的Michael Z Lin，与加州大学圣地亚哥分校的钱永健等人发表了题为“Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins”的文章，获得荧光蛋白研究的重要突破——设计了两个荧光蛋白，Clover 和mRuby2,，这两种蛋白具有迄今为止最明亮的荧光性和RFP特性。相关成果公布在Nature Methods杂志上。

华裔科学家钱永健曾与另外两位科学家，由于在发现和研究绿色荧光蛋白GFP方面做出的贡献而获得了诺贝尔化学奖。Michael Z Lin在博士后期间曾在钱永健实验室学习工作，这两师徒对于荧光蛋白都有着浓厚的兴趣。

荧光蛋白之间的能量共振转移FRET被广泛用于监测活细胞的生化过程，大部分以FRET为基础的报告系统都采用的是CFPS和YFPs作为荧光基团。然而，这两者在FRET上都存在问题，不少CFP-YFP报告系统会出现FRET低动力范围，CFP的激发光合复杂光动能事件，比如可逆光漂白和光电转换，还会带来光毒性。

而且许多CFP和YFP为基础的FRET报告系统会出现荧光共振能量转移的微小变化，因此当生化反应很微小，或或短暂的时候，就会造成检测的困难。如果能开发出新型的荧光蛋白，就能克服CFPs和YFPs中出现的问题。

在这篇文章中，研究人员设计了两个荧光蛋白，Clover 和mRuby2,，这两者分别具有目前为止最明亮的绿色和红色，并且具有此前没有达到的，最高的Förster临界半径（Förster radius）——是指每一对FRET间50%能量转移时的距离。

研究人员从Aequorea victoria GFP和RFP mRuby20入手，构建了最明亮的荧光蛋白：Clover 和最明亮RFP特性的mRuby2，这两者有更大的动态范围，以及在现有四种FRET报告基因设计中的光稳定性。

利用改进的报告系统——电压传感器，能更可靠的检测单个动作电位。此外，研究人员采用了改进的RhoA报告系统进行了验证，研究显示利用这些系统，在神经神经生长锥 ephrinA刺激回缩过程中，RhoA的活性能迅速的被检测到。

在激酶活性报告系统中利用Clover 和mRuby2替换CFP和YFP，小分子GTPase活性和跨膜电压显著提高了耐光性，FRET的动态范围和发射率变化，这些改进能提高对短暂生化事件的灵敏性。

除此之外，近期南加州大学一个研究小组利用从水母体内分离出的生物荧光蛋白，“看到”了蛋白定向地通过神经元以及大脑重建的过程。

上世纪九十年代中期，科学家从水母体内分离出绿色荧光蛋白（GFP）。GFP受到蓝光照射时，会发出亮绿色的荧光。用GFP做标记让人们能看到细胞和神经元内部的蛋白质。但因为神经元内有许多不同的、互相重叠连接的路径，至今还无法看到蛋白质在神经元内部的流动。

研究人员开发出一种新技术，让人们进一步看清了蛋白质是怎样定向进入到两种区室之一的。他们通过阻塞单条路径，使浸满了GFP的运输泡产生堆积。运输泡是一种携带膜蛋白的小泡泡，能在神经细胞内上下移动。然后用一种小分子药物，使这些堆积的发光运输泡在一次强光脉冲下突然释放。

结果发现那些携带膜蛋白质的运输泡，应该进入树突的并不是一开始就瞄准了树突区室，而是两种区室都有进入。但那些进入轴突区室的很快就停下来，被阻止进一步深入。

（生物通：万纹）

原文摘要：

Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins

A variety of genetically encoded reporters use changes in fluorescence (or Förster) resonance energy transfer (FRET) to report on biochemical processes in living cells. The standard genetically encoded FRET pair consists of CFPs and YFPs, but many CFP-YFP reporters suffer from low FRET dynamic range, phototoxicity from the CFP excitation light and complex photokinetic events such as reversible photobleaching and photoconversion. We engineered two fluorescent proteins, Clover and mRuby2, which are the brightest green and red fluorescent proteins to date and have the highest Förster radius of any ratiometric FRET pair yet described. Replacement of CFP and YFP with these two proteins in reporters of kinase activity, small GTPase activity and transmembrane voltage significantly improves photostability, FRET dynamic range and emission ratio changes. These improvements enhance detection of transient biochemical events such as neuronal action-potential firing and RhoA activation in growth cones.