生物通报道  来自西北农林科技大学的研究人员成功利用锌指切口酶（zinc-finger nickases,ZFN）介导将溶葡萄球菌素（lysostaphin）基因插入到β-酪蛋白（beta-casein）基因座，由此构建出了活产基因靶向性克隆牛。这一突破性的研究成果发表在10月14日的《自然通讯》（Nature Communications）杂志上。

领导这一研究的是西北农林科技大学的张涌（Yong Zhang）教授，其多年从事哺乳动物发育生物工程理论和技术研究。是国家级“有突出贡献专家”。

ZFN是一种适用于基因组工程操纵、实现定向突变的强有力的工具。ZFNs切割DNA，在基因组中生成位点特异性双链断裂(DSBs)。或通过非同源末端连接(NHEJ)修复双链断裂，往往会在连接断点导入短的插入或缺失(indels)，或是通过同源重组修复（HDR）拷贝姐妹染色单体忠实地修复原始序列。尽管非同源末端连接是高等真核细胞和生物体主要的双链断裂修复信号通路，目前研究人员利用了这两种信号通路来实现定点基因组修饰。

当前，ZFNs被广泛地应用于基础研究、生物技术和医学领域，但由于不可避免地生成双链断裂以及非同源末端连接的易出错性，利用可编程核酸酶进行基因组工程操纵受到限制。并且，这些可编程核酸酶往往会在高度同源的位点诱导出随机生成及不需要的缺失。而且核酸酶诱导太多脱靶双链断裂对细胞有害。此外，要正确地分离出基因靶向细胞也不是件容易的事情。

克服这些局限的一种潜在策略就是，靶向性导入到包含一个单链断裂（SSB）或切口的DNA中。像双链断裂一样，单链断裂/切口理论上可以刺激同源重组修复信号通路。与双链断裂相比，切口或SSB不是非同源末端修复的底物。因此，靶向性SSB有潜力将修复限定至同源重组修复信号通路。

溶葡萄球菌素可由溶血性葡萄球菌自然生成，已有人提出用它来进行全身性治疗溶血性葡萄球菌感染。在小鼠模型中，溶葡萄球菌素已被证实能够对抗溶血性葡萄球菌引起的乳腺炎。有研究报道，乳汁中表达溶葡萄球菌素的转基因牛能够抵抗溶血性葡萄球菌乳房感染。然而在体外采用哺乳动物细胞生成的溶葡萄球菌素由于糖基化有可能发生蛋白质失活。因此，修改编码序列生成Gln125,232-溶葡萄球菌素确保了两个潜在糖基化位点被移除。这可以防止蛋白质糖基化并恢复部分蛋白质活性。

在新研究中，研究人员的目的旨在通过在牛胚胎成纤维细胞内将外源性Gln125,232溶葡萄球菌素基因插入到β-酪蛋白基因座中，进行有效、可重现的基因靶向，从而使得基因靶向牛的乳腺能够生成溶葡萄球菌素蛋白。

研究人员随后证实了，在牛胚胎成纤维细胞中将ZFNickases靶向内源β-酪蛋白基因座，通过同源重组修复刺激可添加溶葡萄球菌素基因。他们发现，ZFNickase处理细胞可成功用于体细胞核移植，生成了活产的基因靶向牛（gene-targeted cow）。并且，这些基因靶向牛的乳汁中分泌溶葡萄球菌素，体外分析证实这种牛奶能够杀死金黄色葡萄球菌。研究人员表示，在这一策略上取得的成功将推动新的转基因技术让农业和生物医学获益。

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文摘要：

Zinc-finger nickase-mediated insertion of the lysostaphin gene into the beta-casein locus in cloned cows

Zinc-finger nickases (ZFNickases) are a type of programmable nuclease that can be engineered from zinc-finger nucleases to induce site-specific single-strand breaks or nicks in genomic DNA, which result in homology-directed repair. Although zinc-finger nuclease-mediated gene disruption has been demonstrated in pigs and cattle, they have not been used to target gene addition into an endogenous gene locus in any large domestic species. Here we show in bovine fetal fibroblasts that targeting ZFNickases to the endogenous β-casein (CSN2) locus stimulates lysostaphin gene addition by homology-directed repair. We find that ZFNickase-treated cells can be successfully used in somatic cell nuclear transfer, resulting in live-born gene-targeted cows. Furthermore, the gene-targeted cows secrete lysostaphin in their milk and in vitro assays demonstrate the milk’s ability to kill Staphylococcus aureus. Our success with this strategy will facilitate new transgenic technologies beneficial to both agriculture and biomedicine.

作者简介：

张涌

研究方向:
物克隆与转基因技术、动物胚胎工程

个人简历:
1987年7月—1987年12月，西北农业大学兽医系任助教。
1987年12月—1990年2月，西北农业大学兽医系攻读博士学位。
1990年2月—1990年6月，西北农业大学兽医系任讲师。
1990年6月—1992年12月，西北农业大学兽医系任副教授、硕导 。
1993年1月—1999年9月，西北农业大学兽医系任教授、博导。
1999年9月—2007年9月，西北农林科技大学动物科技学院任教授、博导。
2007年9月至今，西北农林科技大学动物医学院教授、博导。

科研项目：
1.良种牛胚胎体外生产技术研究与开发，项目编号：20061666。国际科技合作项目，2008-2010年，总经费73万元。项目主持人。
2. 体细胞高效克隆技术研究，863重点课题，2008-2010年，总经费950万元。课题主持人。
3. 抗病转基因牛新品种培育，项目编号：2008ZX08007-004。

荣誉及奖项：
国家级“有突出贡献专家”，“做出突出贡献的中国博士学位获得者”，”国家“百千万人才工程”入选者。 获得部省级科技进步奖5项，中国青年科技奖、霍英东青年教师奖、中华农业科教奖农业科研奖各一项。

社会兼职：
兼任国务院学位委员会学科评议组成员，陕西省学位委员会委员、陕西省政府决策咨询委员会特邀委员、陕西省政协委员，陕西省动物学会副理事长，陕西省畜牧兽医学会副理事长。

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