NADPH氧化酶是一种与哺乳动物嗜中性粒细胞gp91phox同源的氧化还原酶，主要参与植物的防御反应，并调节植物的生长发育。当植物受到生物或非生物胁迫时，该酶会大量产生活性氧，使植物及时对逆境胁迫做出反应，以适应外界环境的变化。尽管对该蛋白的功能已有不少研究报道，但其在活细胞中参与逆境胁迫的机制尚不清楚。

　　中国科学院植物研究所科研人员及其合作者应用可变角度的全内反射荧光显微镜，结合单颗粒追踪分析技术，在单分子水平上对拟南芥细胞质膜NADPH氧化酶D（RbohD）进行了活体动态分析。

    结果发现，绿色荧光蛋白标记的NADPH氧化酶（GFP-RbohD）主要分布在细胞膜上，与膜结构的荧光标记物FM4-64共定位，并且该蛋白的定位与囊泡循环的过程密切相关。利用单颗粒追踪和单分子荧光漂白等技术分析发现，GFP-RbohD在细胞膜上呈高度动态和不均一分布，主要以单聚体和二聚体的形式存在。

    运用NADPH氧化酶抑制剂（DPI）、钙离子载体（ionomycin）等处理转基因材料，发现GFP-RbohD在细胞膜上的扩散系数受到明显影响，说明其运动状态与活性密切相关。在盐胁迫下，GFP-RbohD会通过胞吞进入胞质，使质膜上具有活性的RbohD蛋白减少。与笼型蛋白Clathrin、膜微区标志蛋白Flot1等三维共定位分析显示，该蛋白与它们均有不同程度的共定位，同时笼形蛋白依赖的途径和膜微区依赖的途径共同参与调控了GFP-RbohD的内吞，特别是在高盐胁迫下，膜微区途径显著增强，使得该蛋白受降解的比例显著增高。

　　研究结果从单分子水平上分析了RbohD蛋白的分布、运动状态以及胞吞过程的变化规律，揭示了植物细胞可以通过调节该蛋白在质膜上的运动状态及胞吞转运方式，从而实现对逆境自我调节的机制。

   研究结果近期在线发表在国际学术期刊The Plant Cell上。植物所副研究员郝怀庆和博士生范路生为该研究论文的并列第一作者，通讯作者为林金星研究员。研究得到了“973”项目资助和国家自然科学基金委的支持。

原文摘要：

Clathrin and Membrane Microdomains Cooperatively Regulate RbohD Dynamics and Activity in Arabidopsis

Arabidopsis thaliana respiratory burst oxidase homolog D (RbohD) functions as an essential regulator of reactive oxygen species (ROS). However, our understanding of the regulation of RbohD remains limited. By variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy, we demonstrate that green fluorescent protein (GFP)-RbohD organizes into dynamic spots at the plasma membrane. These RbohD spots have heterogeneous diffusion coefficients and oligomerization states, as measured by photobleaching techniques. Stimulation with ionomycin and calyculin A, which activate the ROS-producing enzymatic activity of RbohD, increases the diffusion and oligomerization of RbohD. Abscisic acid and flg22 treatments also increase the diffusion coefficient and clustering of GFP-RbohD. Single-particle analysis in clathrin heavy chain2 mutants and a Flotillin1 artificial microRNA line demonstrated that clathrin- and microdomain-dependent endocytic pathways cooperatively regulate RbohD dynamics. Under salt stress, GFP-RbohD assembles into clusters and then internalizes into the cytoplasm. Dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy analysis further showed that salt stress stimulates RbohD endocytosis via membrane microdomains. We demonstrate that microdomain-associated RbohD spots diffuse at the membrane with high heterogeneity, and these dynamics closely relate to RbohD activity. Our results provide insight into the regulation of RbohD activity by clustering and endocytosis, which facilitate the activation of redox signaling pathways.

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