生物通报道：基因表达实验可以揭示蛋白质的功能，不过要精确控制基因的表达还比较困难，特别是在合成生物学和基因治疗领域。现在科学家们利用CRISPR技术构建出了一种新型载体，该载体在哺乳动物细胞中产生蛋白合成脉冲之后就会降解，由此控制蛋白质的表达量和表达时间。这项研究发表在Nucleic Acids Research杂志上。

为了实现精确可控的基因递送，德克萨斯大学Leonidas Bleris决定带领研究团队设计半衰期短的质粒，“我们很快决定采用CRISPR-Cas9技术，”他说。

研究人员设计的质粒载体携带有目的基因、Cas9核酸酶和引导Cas9剪切的gRNA。当这样的质粒进入细胞之后，就会生产这三种蛋白。随后gRNA引导Cas9酶去切掉质粒，抑制进一步的蛋白生产并降解载体。而已经表达的蛋白最终会被细胞分解掉。

研究人员在这个质粒中添加了方便检测的荧光蛋白mKate2，还选择了两种在人类基因组中脱靶最少的gRNA。由于mKate2半衰期较长，研究人员在它的C端加上了加速其降解的氨基酸序列。研究显示，质粒进入人类细胞后产生了明亮的荧光脉冲，荧光在七小时之后达到峰值，随后慢慢衰退。（延伸阅读：Cell子刊：组织特异性的CRISPR载体）

在证明了质粒的有效性之后，研究人员开始对这一系统进行微调。他们通过计算机模拟分析了载体量、mKate2稳定性、剪切复合体与靶点亲和力所产生的影响，并在此基础上构建了不同版本的递送系统。“蛋白质稳定性和CRISPR系统的剪切效率，决定着蛋白的表达量和表达时间，”Bleris说。

研究人员建立了能够满足一系列递送性能的载体文库，包括不同的蛋白合成量和蛋白合成时间。除了提供基因治疗所必须的精确控制，这些载体在合成生物学中也很有价值。“这一机制还可以用来实现无痕递送，甚至保护知识产权，”他补充道。举例来说，让gRNA靶标递送载体上的多个靶标，可以在引入治疗性蛋白之后将载体完全降解，以保护载体上的专利序列。

生物通编辑：叶予

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Moore R, Spinhirne A, Lai MJ, Preisser S, Li Y, Kang T, Bleris L. CRISPR-based self-cleaving mechanism for controllable gene delivery in human cells. Nucleic Acids Res. 2015 Jan;43(2):1297-303.