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生物通报道：基因工程猪可作为动物模型研究人类疾病, 也是异种器官移植最合适的供体. CRISPR/Cas9系统是高效特异的基因编辑工具. 近期来自温州医科大学检验医学院, 生命科学学院的研究人员通过显微注射的方式将sgRNA和Cas9 mRNA注射入单细胞期的孤雌胚胎中, 待其发育为囊胚后检测打靶效率. T7EN1酶切和TA克隆测序结果表明, 这一研究可以在猪的孤雌胚胎中同时实现3个基因(B2M, CIITA, GGTA1或者LDLR, LEP, LEPR)的高效敲除(敲除率分别为62.5%和50%), 为使用CRISPR/Cas9系统高效、快速和经济地建立多基因修饰的猪模型提供了基础.

CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins 9)系统是近年基因编辑的研究热点, 具有省时、花费低廉和编辑效率高等特点. 自2010 年Jinek 课题组在Science上发表了利用化脓链球菌中的TypeⅡ CRISPR/Cas9系统可以切割质粒DNA的论文之后, CRISPR/Cas9 系统作为一种新型的基因编辑工具迅速风靡全球.

与ZFN和TALEN需要构建高特异性的DNA结合蛋白来精确靶向基因位点不同, Cas9核酸内切酶只需要提供一个包含特异的20 nt的小片段sgRNA(single guide RNA)来决定靶向特异性. sgRNA是由crRNA(CRISPR RNA)与tracrRNA(trans-activating CRISPR RNA)嵌合构成的一个约100个核苷酸大小的RNA. crRNA能够与靶向的DNA形成RNA- DNA复合物, 这段靶向DNA序列叫做前间隔序列(protospacer). crRNA 与trancrRNA 一起构成的sgRNA与Cas9相互作用形成核糖核蛋白. sgRNA 的5′端的约20 nt(对应的是crRNA)通过RNA-DNA互补配对指引Cas9与靶序列结合进而对靶位点进行切割, 造成DNA双链断裂(double strand break, DSB). 在细胞中, 核酸酶造成的DSB在没有修复模板的情况下, 以非同源末端连接(nonhomologous end-joining, NHEJ)的方式进行修复. NHEJ 能够引起随机长度的碱基插入或缺失(insertion/deletion mutations, indels), 可以破坏编码基因的翻译阅读框架.

一些研究表明, 通过猪受精卵胞质注射Cas9 mRNA和sgRNA能够有效地构建双等位基因敲除的猪模型, 证实了这种方法的可行性. 此前, Zhou等人将Cas9 mRNA与多个sgRNA混合注入小鼠受精卵胞质中, 实现了小鼠进行多基因修饰, 成功构建免疫缺陷小鼠模型.

猪妊娠期长、受精卵采集比较困难、花费高等制约了基因工程猪的构建, 贸然注射不经过验证效率的sgRNA 风险较大, 虽然可以在猪成纤维细胞中检测sgRNA 的效率, 但是不能反应在体的实际情况. 因此在这项研究中，研究人员拟在猪孤雌胚胎中验证应用CRISPR/Cas9构建多基因修饰猪模型的可行性. 因此研究选择了与免疫排斥相关基因B2M(2 microglobulin), CIITA(class II transactivator), GGTA1(alpha-1,3-galactosyltransferase)以及脂代谢相关基因LDLR(low-density lipoprotein rec- eptor), LEP(leptin), LEPR(Leptin receptor), 每个基因分别设计两个sgRNA, 将每组的sgRNAs+ Cas9 mRNA通过原核注射的方式分别注入猪孤雌胚胎中, 以实现三基因同时敲除. 待其发育至囊胚后检测打靶效率, 以建立高效快速的CRISPR/Cas9打靶位点检测方法, 为构建多基因修饰基因工程猪奠定技术基础.

这项研究利用CRISPR/Cas9在猪孤雌胚胎中实现3 个基因(B2M, CIITA, GGTA1或者LDLR, LEP, LEPR)同时高效敲除, 对以后得到异种器官移植供体猪或者构建代谢障碍猪疾病动物模型提供了一定的基础, 同时整个流程需要大概4~6周的时间, 相比传统基因修饰方法节省更多的时间与精力.

研究方法成功利用猪单个胚胎建立了高效快速的CRISPR/ Cas9打靶位点检测方法, 为系统、高效地改造猪基因组提供了新的思路和方向.

（生物通）

原文检索：

康难难, 陈红全, 高基民. 利用猪单个胚胎建立高效快速的CRISPR/Cas9打靶位点检测方法. 中国科学: 生命科学, 2016, 46: 304–313
Kang N N, Chen H Q, Gao J M. Efficient generation of multiple-gene knockout pig parthenogenetic embryos by using CRISPR/Cas9 system and rapid estimation of knockout efficiency by single blastocyst genotyping. Sci Sin Vitae, 2016, 46: 304–313, doi: 10.1360/N052016-00034