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生物通报道： 为在斑马鱼中获得特异且高效的基因敲除,多个实验室独立人工合成了序列彼此不一的Cas9 cDNA序列,并克隆入不同的体外转录载体。来自中国科学院水生生物研究所,淡水生态与生物技术国家重点实验室的研究人员选取 两种斑马鱼密码子优化的Cas9编码序列(zCas9_bz和zCas9_wc),对斑马鱼胚胎中的7个基因(外源egfp及内源chd、hbegfa、th、eef1a1b、tyr、tcf7l1a)分别进行敲除,通过PCR产物测序、克隆测序和表型分析比较了两种Cas9的敲除效率。结果发现,zCas9_wc在各种情况下都显现出较高的敲除效率,而zCas9_bz的效率相对较低。

基因敲除是开展基因功能研究最为重要的技术手段之一。近年来，新一代人工核酸内切酶技术——CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein)被广泛地应用于小鼠、果蝇、斑马鱼、线虫等各种模式生物的基因敲除和基因功能研究。

CRISPR是一类广泛分布于细菌基因组中的重复结构，经转录并加工成短的crRNA(CRISPR RNA)。crRNA通过碱基配对与tracrRNA(Trans-activating RNA)结合，形成双链RNA，引导内切酶Cas蛋白在crRNA序列靶标的特定位点剪切双链DNA。据此，科研人员typeⅡCRISPR/Cas系统中的crRNA和tracrRNA 连接起来成为一条引导RNA(GuideRNA, gRNA)，即可利用其对真核生物基因组进行改造，从而在靶标DNA上实现特定位点的剪切，靶标DNA利用非同源末端连接(Non-homologous end joining, NHEJ)机制进行双链DNA修复的过程中有可能引入插入或缺失(Indel)突变。

斑马鱼具有饲育容易、体外受精、体外发育、胚胎透明、组织器官再生能力强等诸多优点，从而成为研究脊椎动物发育与人类遗传疾病的重要模式动物。由于斑马鱼产卵量较大且易于显微注射，以CIRSPR/Cas9基因组编辑技术为基础，研究者先后在斑马鱼中实现了基因组水平的定点敲入、多基因平行敲除、同源序列介导的精确整合等。在利用CRISPR/Cas9技术制备斑马鱼突变品系的过程中，往往需要保证较高的P0代突变效率，从而减少后续突变体筛选所需投入的人力和物力。目前，在斑马鱼研究领域较为广泛使用的Cas9基因序列包括根据哺乳动物密码子优化的人源化hCas9，以及根据斑马鱼密码子优化的zCas9 等。

在这篇文章中，研究人员选取了zCas9_bz和zCas9_wc两种斑马鱼密码子优化的Cas9编码载体体外合成mRNA，针对斑马鱼外源egfp基因以及chd、hbegfa、th、eef1a1b、tyr和tcf7l1a等6个内源基因进行敲除，并逐一比较了这两种Cas9对这7个基因在特定靶位的敲除效率，以期为研究者日后选用Cas9在斑马鱼中进行基因敲除提供参考。

这项研究采取了靶点PCR产物直接测序法。该方法非常简单易行，仅需要开展一次PCR反应和一个测序反应。一般而言，从显微注射到效率评估可以在3日内完成。对突变靶点的序列详细分析表明，这两种Cas9蛋白导致的靶位突变并不存在序列上的偏好性，因此这两种Cas9敲除效率的差异应该不是由于Cas9识别靶位的特异性所导致，而可能是由于密码子优化、Kozak序列、核定位信号、N端标签等诸多因素的存在与否所综合导致。

研究人员还发现一个有趣的现象：针对早期发育必需基因chd进行Cas9敲除时，获得了典型的腹部化表型，测序结果分析表明所有出现腹部化表型的胚胎均可获得100%的敲除效率，而表型为野生型的胚胎的敲除效率则为0%。后续养殖实验显示，出现腹部化表型的胚胎很难被继续饲养至性成熟，而仅有那些没有出现表型的胚胎可以被养至性成熟。这就出现了一个敲除效率和养殖存活率之间的悖论：亦即从获得基因敲除子代的角度而言，必需选取那些具有显著表型的胚胎继续饲养；而从养殖存活率的角度而言，又限制了我们选取这部分胚胎。因此，在日后的研究中，当涉及到早期发育必需基因的高效敲除时，可能需要利用原始生殖细胞替换等技术手段来解决这一问题。

这一研究针对斑马鱼外源egfp基因及chd、hbegfa、th、eef1a1b、tyr、tcf7l1a 等6个内源基因的共计7个靶位，通过PCR产物测序、克隆测序和表型分析，系统比较了zCas9_bz及zCas9_wc对其敲除的效率。结果显示zCas9_wc效率较高，且对相当多的靶位的敲除效率接近100%。这为研究者日后在斑马鱼中开展CIRSPR/Cas9介导的基因敲除时选择Cas9编码序列提供了有益的参考。

原文检索：

张峰华,王厚鹏,黄思雨,熊凤,朱作言,孙永华. 两种密码子优化的Cas9编码基因在斑马鱼胚胎中基因敲除效率的比较[J]. 遗传, 2016, 38(2): 144-154.
Fenghua Zhang, Houpeng Wang, Siyu Huang, Feng Xiong, Zuoyan Zhu, Yonghua Sun. A comparison of the knockout efficiencies of two codon-optimized Cas9 coding sequences in zebrafish embryos. HEREDITAS(Beijing), 2016, 38(2): 144-154.