右侧：在AAV-CRISPR-Cas9进行Nrl敲除后2.5个月之后，视网膜感光层中的Nr1表达显著降低；左侧：用针对EGFP的AAV-CRISPR-Cas9处理作对照

生物通报道：美国国立卫生研究院眼科研究所的一组研究人员报道了最新成果：他们通过一种病毒载体直接向眼睛输送了基于CRISPR-as9的治疗元件，成功在视网膜变性小鼠中阻止了视网膜色素变性。这一研究成果公布在3月14日的Nature Communications杂志上，文章的通讯作者是美国国立卫生研究院眼科研究所的吴志坚研究员（Zhijian Wu，音译）。

视网膜色素变性（Retinitis pigmentosa）是一种具有明显遗传倾向的慢性、进行性视网膜色素上皮和光感受器的变性疾病，发病率大约为四千分之一，会引发视网膜变性，并最终导致失明。这种遗传性疾病已与超过60个基因（和超过3,000个突变）相关联，因此为基因治疗增加了难度，最新这项研究的结果表明，基于基因编辑的更广泛治疗方法可用于靶向视网膜色素变性中的多个遗传缺陷。

在视网膜的眼后部组织中有两种类型的细胞，能将光转换成电信号发给大脑，视杆光感受器能在昏暗的光线下产生视觉，而视锥光感受器则能在光照条件下实现色彩视觉和观察。遗传突变主要影响前者，导致夜盲症，就像是视网膜色素变性患者看到的那样。不过由于视杆光感受器也会为视锥光感受器提供重要的结构和营养支持，因此视杆光感受器障碍或死亡会导致视锥光感受器变性和失明。

为此眼科研究所眼部基因治疗中心主任吴志坚等人设计了一种CRISPR单导向RNA（sgRNA），靶向视网膜转录因子：神经视网膜亮氨酸拉链（Neural retina leucine zipper，Nrl），Nrl能调控视网膜发育过程中特殊视杆细胞的命运，并维持成熟视网膜内的视杆细胞。研究小组将Nrl-sgRNA和Cas9内切核酸酶通过两个单独的腺相关病毒（AAV）载体，直接递送到小鼠视网膜上。他们指出，这种AAV载体的优点就是能维持非分裂细胞（例如视网膜细胞）中长期基因表达的能力。

来自华盛顿大学医学院的神经病理学家Joseph Corbo（未参与该项研究）表示，“目前缺乏针对视网膜变性的有效治疗，特别是缺乏这种疾病不同遗传变异的治疗，这项研究是我们领域中非常令人激动的一项重要进步”。Corbo实验室是第一个发现靶向Nrl可以保留小鼠视锥细胞功能的实验室。

在最新研究中，研究人员利用基于Cre的重组系统，发现敲除Nrl可以将视杆细胞部分转换类似视锥细胞，防止视杆细胞的死亡以及视网膜色素变性中二级视锥细胞的死亡。

吴志坚研究员表示，“我们的想法不是将视杆细胞转变成真正的视锥细胞，而是令它们获得一些视锥细胞的特征，从而能低空引发其最终死亡的突变影响。”

但Cre重组方法并不使用于人体，因此研究人员转向了CRISPR系统。 “这项新工作获得了两个方面的进步：作者采用了了一种AAV介导的CRISPR-Cas9递送系统，可以应用于人类患者，并且他们指出了这种策略可以在多种视网膜变性模型中起作用。”

研究组首先将实验治疗载体注射到2周龄野生型小鼠的视网膜中，然后观察小鼠在三至四个月内的变化。与注射对照载体的小鼠相比，接受治疗的小鼠Nr1表达量降低。在注射后第6周，治疗小鼠视杆细胞出现了下调的视杆细胞基因，以及上调的视锥细胞基因。同时研究人员也指出，这种治疗不会对视锥细胞产生任何有害作用。

这种完整消除Nrl的效果令人印象深刻，也是这项工作的一个关键成果。

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然后，研究组在三种不同的视网膜色素变性小鼠模型上检测了载体，其中包括视紫红质基因中表达显性人类突变的模型，之后再观察几个月后小鼠的变化，结果表明在所有三种情况下，治疗小鼠保留了更多的视杆细胞，阻止了视杆细胞和视锥细胞的死亡。

去年年初，美国Cedars-Sinai医学中心的研究人员利用CRISPR-Cas9删除视网膜色素变性的遗传突变，他们将这个系统注入年轻的实验室大鼠体内，这种大鼠已被改造成模拟一种遗传性视网膜色素变性，称为常染色体显性遗传，这涉及到该基因的突变。单次注射后，通过视动反射测量——包括转动头部响应运动不同亮度的条纹，研究人员发现，与对照组动物相比，这些大鼠的视力变得更好。华人女学者用CRISPR技术改善遗传性失明

之后，哥伦比亚大学医学中心（CUMC）等处的Stephen Tsang等人也利用一种基于CRISPR的方法来修复人类和小鼠视网膜色素变性相关的突变，而他们利用的是视网膜色素变性患者的皮肤样品制备干细胞。由于病人来源的干细胞仍携带有致病基因突变，因此，该研究团队使用CRISPR来修复有缺陷的基因。干细胞可被转化为健康的视网膜细胞，并移植到同一患者中来治疗视力丧失。研究人员靶定了视网膜色素变性最常见的一个变体，它是由RGPR基因中一个单一错误引起的。RGPR的组成——其中包含许多重复和紧密结合的核苷酸对，使它成为一个很难编辑的基因。

对于最新成果，Tsang表示，“这种类型的‘不精确医学方法’可能患有视网膜色素变性的任何患者的第一个应用，因为有67个基因。”

不过在人体进行检测之前，还需要回答几个问题，比如Cas9的长期表达是否对视网膜有害，以及Nrl的消除在人体中是否能有小鼠中相同的效果。

佛罗里达大学的Shannon Boye评论道，“还需要更多的研究来确保实验结果，但这些研究对于分析CRISPR-Cas9在有丝分裂后神经元中的作用方面令人鼓舞。”

“CRISPR技术与腺相关病毒载体的组合，这尝试真正将遗传信息递送到视网膜上，也许代表了视杆细胞相关退行性疾病治疗方面的第一步。”

（生物通：张迪）

备注：

视网膜色素变性 retinitis pigmentosa

　　视网膜色素变性（retinitis pigmentosa）是一种具有明显遗传倾向的慢性、进行性视网膜色素上皮和光感受器的变性疾病。其遗传方式可为常染色体显性遗传或隐性遗传，也有散发病例。开始于儿童期，至青春期加重，多双眼受累。

　　（一）病因
　　目前认为视网膜色素变性是由于色素上皮内高度发育的吞噬酶系统有缺陷致使光感受器细胞外节　，尤其是视杆细胞外节　的吞噬作用出现缺陷，影响了外节　的新陈代谢，脱落的盘膜堆积，可能成为自身性抗原，发生自身免疫反应。这种色素上皮的缺陷与遗传有关。此外，尚有内分泌障碍，微量元素铜铁代谢异常，营养障碍及视网膜脉络膜硬化等假说。

　　（二）病理
　　早期在赤道部的视杆细胞、色素上皮细胞与光感受器细胞同时发生变性和增殖改变，增生的上皮细胞和巨噬细胞移行到视网膜内和静脉附近的血管层。游离的色素颗粒聚集在视网膜血管周围，视网膜血管外膜增厚，管径明显缩小，管腔狭窄，神经胶质增生。晚期脉络膜毛细血管消失，视网膜内核层及神经节　细胞层变性。

　　（三）临床表现
　本病特点：很早就有夜盲，暗适应减低，中心视力可保持很久，但视野逐渐缩小，及至晚期中心视力减退，视野呈管状，病人行动困难，工作和生活均感不便。

　　眼底特征：视网膜血管高度狭窄，尤以动脉显著。晚期血管可呈细线条状，视盘呈腊样黄白色，边缘清楚，生理凹陷存在，视网膜呈青灰色，色素游离，初起时是在赤道部，沿血管分布，以后逐渐增多，变粗大，状似骨细胞，并向后极部及周边扩展（图12－9）。还可并发白内障、脉络膜硬化和黄斑退变，或伴有小眼症和青光眼等。还有一种情况是临床症状与本病相同，但眼底无色素游离，叫无色素性视网膜色素变性。

原文检索：

W. Yu et al., “Nrl knockdown by AAV-delivered CRISPR/Cas9 prevents retinal degeneration in mice,” Nature Communications, doi:10.1038/ncomms14716, 2017.