生物通报道：CRISPR-Cas9基因组编辑技术给分子生物学领域带来了一场变革。研究者们只需使用细菌核酸酶Cas9和引导酶切位点的短RNA，就能够在活体生物中有效敲除或者改变基因序列，这为许多疾病的治疗带来了新希望。

视网膜色素变性（Retinitis pigmentosa）是一种具有明显遗传倾向的慢性、进行性视网膜色素上皮和光感受器的变性疾病，发病率大约为四千分之一，会引发视网膜变性，并最终导致失明。这种遗传性疾病已与超过60个基因（和超过3,000个突变）相关联，因此为基因治疗增加了难度。最近来自美国国立卫生研究院眼科研究所的一组研究人员通过一种病毒载体直接向眼睛输送了基于CRISPR-Cas9的治疗元件，成功在视网膜色素变性小鼠中阻止了细胞的死亡。

这一研究成果公布在3月14日的Nature Communications杂志上，文章的通讯作者是眼科研究所的伍志坚研究员（Zhijian Wu，音译），第一作者为余文瀚（Wenhan Yu）博士，余文瀚博士指出，“AAV载体是可以安全、高效地转导光感受器细胞和其他一些视网膜细胞的成熟系统。它携带的基因能够在光感受器细胞这种非分裂细胞中长期存在表达。它解决了将CRISPR-Cas9系统安全有效传递到体内的问题”。

先进的CRISPR-Cas9技术

在视网膜的眼后部组织中有两种类型的细胞，能将光转换成电信号发给大脑，细胞占所有感光细胞的95%以上，能在昏暗的光线下产生视觉；视锥光感受器（视锥细胞）虽然只占5%，却主要负责在日常光照条件下产生视觉以及颜色识别。导致视网膜色素变性的遗传突变一般首先影响前者，产生夜盲症状。而由于视杆细胞还会为视锥细胞提供重要的结构和营养支持，因此视杆细胞的缺陷或死亡会导致视锥光感受器继发性变性，最终导致失明。

在视网膜发育过程中，决定感光细胞前体是否发育成为视杆细胞的关键基因是一种转录因子，称为神经视网膜亮氨酸拉链（Neural retina leucine zipper，Nrl）。在发育成熟的视网膜中，Nrl也负责维持视杆细胞的功特性。2013年，华盛顿大学Corbo教授的研究小组曾利用基于Cre的重组系统，发现敲除Nrl可以将视杆细胞转换视锥样细胞（cone-like cells），并在视网膜色素变性的小鼠中防止视杆细胞的死亡以及视锥细胞的继发性死亡。但因为基于Cre的重组系统不能用于病人，这个策略在当时不能转化到临床用途。

伍志坚的研究小组利用CRISPR-Cas9技术，为这个策略的临床转化探索出了一条途径。他们将靶向Nrl的导向RNA（gRNA）和Cas9内切核酸酶通过两个单独的腺相关病毒（AAV）载体，直接递送到小鼠视网膜上。他们指出，这种AAV载体的优点就是能维持非分裂细胞（例如光感受器细胞）中长期基因表达的能力。“这项新工作获得了两个方面的进步：作者采用了了一种AAV介导的CRISPR-Cas9递送系统，可以应用于人类患者，并且他们指出了这种策略可以在多种视网膜变性模型中起作用。”Corbo教授这样评价。

余文瀚博士解释道，“我们对接近成熟（2周）的小鼠注射AAV-CRISPR，加上AAV系统携带的基因表达需要一定时间，我们判断实际上Cas9蛋白表达达到峰值，系统真正起效的时候小鼠已经至少4周大了。这时光感受器细胞已经完全发育完成，所以视杆细胞很难再完全转变成视锥细胞。华盛顿大学Corbo教授组之前的PNAS文章也显示，随着视杆细胞的发育，一些视杆细胞特异性基因，像Rhodopsin，其启动子被特定修饰，在修饰以后，敲除Nrl基因基本对其表达没有影响。

事实上，我们并不希望将视杆细胞真正转变成视锥细胞（一般是转变成s-cone）。这种转变在临床上叫做“Enhanced S Cone Syndrome”，一般就与NRL基因突变有关系。我们没有完全转变恰恰提示如果我们的方法转化到临床以后，可能并不会导致与NRL基因突变相关疾病相同的病变。”

研究组首先将实验治疗载体注射到2周龄野生型小鼠的视网膜中，然后观察小鼠在三至四个月内的变化。与注射对照载体的小鼠相比，接受治疗的小鼠Nrl表达量降低。在注射后第6周，治疗小鼠视杆细胞出现了下调的视杆细胞基因，以及上调的视锥细胞基因。同时研究人员也指出，这种治疗不会对视锥细胞产生任何有害作用。

然后，研究组在三种不同的视网膜色素变性小鼠模型上检测了载体，其中包括视紫红质基因中表达显性人类突变的模型，之后再观察几个月后小鼠的变化，结果表明在所有三种情况下，治疗小鼠保留了更多的视杆细胞，阻止了视杆细胞和视锥细胞的死亡。

视网膜色素变性治疗的重要突破

去年年初，美国Cedars-Sinai医学中心的研究人员利用CRISPR-Cas9删除视网膜色素变性的遗传突变，与其相比，最新这项研究“有两方面重要的区别：1）以前的研究一般针对单一基因突变，我们的策略理论上可以针对绝大部分视杆细胞相关基因突变引起的视网膜色素变性；2）以前的研究一般是在新生小鼠眼内注射质粒，通过electroporation传递基因，此时视网膜还未停止发育，一些细胞还会分裂分化；而我们的方法是用AAV传递CRISPR-Cas9系统，对接近成熟（2周）或成熟（4-5周）小鼠进行治疗，主要针对非分裂细胞”，余文瀚博士说。

而且这一策略理论上可以针对大多数基因相关的RP，“但是我们的AAV-CRISPR系统确实也可以靶向其他的基因。目前更容易达到的策略是敲除显性致病基因，类似的研究已经有报道。当然，未来随着技术的发展，我们希望能够有一天实现基因修复。”

不过在人体进行检测之前，还需要回答几个问题，比如Cas9的长期表达是否对视网膜有害，以及Nrl的消除在人体中是否能有小鼠中相同的效果。

佛罗里达大学的Shannon Boye评论道，“还需要更多的研究来确保实验结果，但这些研究对于分析CRISPR-Cas9在有丝分裂后神经元中的作用方面令人鼓舞。”

余文瀚博士说，“我们只是走了一小步，证明了这个策略的可行性和有效性。我们认为要真正实现临床应用，主要要解决安全性问题，首先要解决CRISPR的安全性，主要是off-target效应。我们的研究在10个可能的off-target位点并没有发现突变，但不能排除其他位点可能发生了突变；也有人认为在体内由于种种原因不容易产生或积存off-target事件，但因为Cas9的持续表达，随着时间推移这种可能性理论上会越来越大。我们期待随着更特异、可控的CRISPR系统的出现，这个问题可以得到解决。其次是策略本身的安全性，也就是我前面提到的NRL基因突变相关疾病的问题，虽然我们的结果表明在视杆细胞发育完成以后敲除Nrl不会将视杆细胞完全转化成视锥细胞，提示可能并不会引起相关的病变，但这个策略本身的安全性还需要在跟人类进化关系更近的灵长类动物上进行验证。”

作者简介：

余文瀚
2014-：博士后研究员，美国国家眼科研究所Ocular Gene Therapy Core
2008-2013: 博士，四川大学生物治疗国家重点实验室
2004-2008：学士，四川大学生命科学学院

研究方向：眼科疾病的基因治疗

主要研究工作：
1. CRISPR/Cas9 介导的视网膜细胞基因编辑
2. CEP290基因变异相关LCA的基因治疗
3. RPGR基因变异相关RP的基因治疗

原文检索：
W. Yu et al., “Nrl knockdown by AAV-delivered CRISPR/Cas9 prevents retinal degeneration in mice,” Nature Communications, doi:10.1038/ncomms14716, 2017.