“CRISPR可以针对任何特定遗传密码，在非常精确的位置编辑DNA，从而让科学家们永久地修改活细胞和模式动物的基因、探索基因功能，”文章共同一作、贝勒医学院Olivier Lichtarge实验室的指导员David Marciano博士。

Dr. David Marciano（左）和Dr. Olivier Lichtarge

“核糖核蛋白复合体切割特定DNA序列，复合体中的引导RNA与目标DNA碱基配对。模块化的核酸/蛋白质复合物允许研究人员几乎可以靶向任何序列，”共同一作、博后学者Toon Swings说。

但是，既有方法也提出了一些挑战，例如潜在的脱靶效应、每个靶基因要求设计独特的导向RNA和目标序列也有一定限制等。Marciano和Swings促成了一项国际合作，共同开发了一个简单的解决方案，避开了以上这些问题。

“我和Toon手里有很多项目，为了靶向不同基因，我们不得不在大肠杆菌中构建许多突变和引导RNAs。我们意识到，如果我们能找到基因敲除合集中的普遍序列，我们就不需要为每个基因设计一个新引导RNA，”Marciano说。“我们在许多重要的遗传医学细菌和几种果蝇中找到了我们想要的打靶序列。”

他们利用了“Keio 收藏（Keio collection）”大肠杆菌克隆图书馆，在这个收藏中，每个克隆都有一个基因被卡那霉素抗性基因取代。

“我们终于在卡那霉素的两个FRT位点侧翼找到了宝贵的切入点，”Swings说。“而且，细菌内含有两个这样的序列，因此很难脱靶。”

这种方法消除了设计和克隆引导RNA的需要，简化了补回模板构建策略，而且Keio收是全球实验室都在使用，单个克隆也容易付费获得。

这种方法还有一些好处，包括方便研究“致命基因”、在单一染色体基因中制造一系列不同突变，以及为基因添加一个新序列。所有这些都可以在基因的自然上下文中进行。该方法是现有大肠杆菌基因工程技术的一个重要补充。

“除了大肠杆菌，许多其他模式生物也有相应的基因替换收藏，我们也可以使用类似的方法，用一个单一的引导RNA打靶，”Swings说。

CRISPR/Cas9基因敲除细胞系（片段敲除）详细资料

原文检索：CRISPR-FRT targets shared sites in a knock-out collection for off-the-shelf genome editing

（生物通：伍松）