17世纪晚期，荷兰商人安东尼·范·列文虎克(Anthoni van Leeuwenhoek)开始使用第一台显微镜研究极小的世界，发现了一个由原生生物、细菌和其他前所未见的生物组成的缤纷世界。后来的几代科学家已经开发出了更加复杂的手段来探索微观世界，将生物领域的许多奥秘带入惊人的境地。

现在，生物设计应用结构发现中心(CASD)和亚利桑那州立大学分子科学学院(SMS)的研究人员作为多机构研究合作的一部分，将显微镜领域向前推进了一步，改进了一种称为低温电子显微镜的技术，或称低温em。

这项技术包括对感兴趣的生物样本进行快速冷冻，然后使用电子束成像并记录数千张二维图像，然后通过计算机将其组装成样品结构的原子轮廓。这些已知的密度图可以被转换成详细的3D图像。

该方法对于找出蛋白质结构的细微之处特别有用，而传统的建模策略往往会忽略这些细节。这些信息对于了解健康和疾病至关重要。由于蛋白质是大多数药物的主要靶点，对其结构和功能的全面了解对于设计更有效、副作用更少的治疗方案至关重要。

这项新的研究描述了一种产生更精确结构的方法，通过一种被称为最大熵的复杂统计方法。这种方法已经被有效地应用于许多领域，从蛋白质研究和神经科学到生态学和动物种群的行为，非常适合于冷冻em数据的细化，产生最无偏的生物样本结构模型。

像蛋白质这样的分子具有复杂的三维形态，并且在其功能过程中也可以改变形状。这项新研究的通讯作者Abhishek Singharoy说:“复杂的生物分子实际上存在于一系列的状态中，你可以对这些分子的不同构象拍一张快照。”其中一些构造可能会在时间上持续存在，但另一些则极其短暂，在以十亿分之一秒为单位的时间尺度上来来去去。

所描述的新技术使研究人员能够模拟这些瞬态结构，这些结构在生物过程中发挥着至关重要的作用，但传统的低温电磁技术常常忽略了它们。

来自伊利诺伊大学的研究人员加入了亚利桑那州立大学的研究小组;普渡大学;法国格勒诺布尔数学与计算机科学系;佛罗里达大学;以及石溪大学。

佛罗里达大学的Alberto Perez说:“这项工作强调了实验室开发的整合和流线化工具是如何与实验数据结合使用的，以促进我们对结构生物学的理解。”

该小组的发现发表在当前的《细胞出版社》杂志的封面上。

只是寒冷

一系列现代成像技术使研究人员能够研究生命的关键分子，包括蛋白质、核酸，甚至是单个分子。低温电子显微镜是电子显微镜的一个变种，于20世纪70年代首次被开发出来。这项技术后来获得了2017年诺贝尔化学奖，授予了该领域的先驱雅克·杜波切特(Jacques Dubochet)、约阿希姆·弗兰克(Joachim Frank)和理查德·亨德森(Richard Henderson)，因为他们开发了低温电子显微镜，用于在溶液中测定生物分子的高分辨率结构。

与其他形式的电子显微镜一样，低温电子显微镜用电子束取代了传统光学显微镜中用于照亮样品的光子。由于显微镜下物体的分辨率被限制在照亮样品的光波长的一半左右，电子的波长更短，这取决于它们的动量，使科学家能够以惊人的清晰度看到微小结构。

Cryo-EM是结构生物学研究中使用的三种方法之一，它与x射线晶体学和核磁共振波谱(NMR)相结合。每种方法都有自己的优点。虽然x射线晶体学可以产生非常高分辨率的令人惊叹的详细结构，特别是使用x射线自由电子激光器或XFEL技术，但该方法很难成像大型或复杂的结构，包括膜蛋白，因为它们很难结晶。核磁共振也是如此。

低温电子显微镜已经成熟

由于样品不需要结晶，可以在其自然的周围环境中进行研究，因此低温电子显微镜在大而复杂的生物分子成像方面取得了长足的进展。近年来，新一代高速摄像机已经被开发出来，以帮助捕捉各种生物分子的动态活动。当研究人员试图从分子的初始二维密度图中提供的原始数据生成三维结构模型时，棘手的部分就出现了。在以前，这涉及到对结构可能的样子进行有根据的猜测，并将密度图中提供的信息拟合到这个模型中。

将原始数据过度拟合到结构模型中可能会产生不准确。相反，新方法对最终的分子结构没有任何假设，除了已知的约束条件。通过产生最无偏的结构，这种最大熵方法可以帮助研究者填补结构确定过程中的空白，更好地解释可能存在于非常低频率的各种构象的贡献。要完全理解像蛋白质这样的生物分子，需要同时确定这些分子所能假定的所有相关状态的结构。

简单地想象一下，试着制作一个模型来说明一个男孩的行为，这个男孩站着不动一个小时，除了偶尔胳膊和腿的短暂动作。平均来说，没有任何变化，结果的男孩模型将由一个静态的，静止的图像组成。另一方面，最大熵方法将允许所有不同的手势，无论多么简短，贡献到最终图像，产生一个更准确的表示。

这项新研究提供了六个不同大小的精心折叠蛋白质的例子，包括大膜和多结构域系统。该结果强调了最大熵统计软件包(称为CryoFold)发现分子集成的能力，包括已经被实验验证并被识别为功能相关的罕见的低概率结构。

最大熵技术可以与现有的数据拟合方法相结合，在迭代过程中将低分辨率数据转化为高分辨率、高置信度的三维结构。这些进展正在帮助冷冻电镜通过表征蛋白质和其他重要生物分子的整个构象景观来发挥其全部潜力。

”这项工作集成了多个基于物理方法提炼蛋白质结构从低温电子显微镜数据,提供没有一个蛋白质的静态图片,而是结构的集合,它代表的是正确的,动态特性的蛋白质,“Chitrak Gupta说,合著者CASD研究员和SMS。

文章标题

CryoFold: Determining protein structures and data-guided ensembles from cryo-EM density maps