一般来说，人类细胞通常会将大约2万个基因中的一半转录成RNA分子。就像蛋白质一样，这些RNA的功能不仅取决于它们的数量，还取决于它们在每个细胞三维空间中的精确定位。许多RNA分子将基因信息从细胞核传递到分布在细胞质中的蛋白质合成分子(信使RNA或mRNAs)中，其他RNA分子是蛋白质合成机器本身的组成部分，但仍有不同的RNA调节基因及其表达具有有待发现的功能。重要的是，包括癌症和神经系统疾病在内的许多疾病的特征表现为RNA的丰度和分布的变化。

George M. Church是哈佛医学院著名的遗传学教授、Wyss研究所的核心成员，被誉为是个人基因组学和合成生物学的先锋。他在2014年报道了一个有效的空间测序技术，这种名为FISSEQ的技术能够同时读成千上万的RNA序列和可视化的三维坐标。然而，FISSEQ对大量RNA靶标的强大测序能力是有代价的：它对其中许多靶标的检测效率和灵敏度相对较低，特别是当这些靶标的表达从一开始就很低或在疾病中被抑制时。

现在，Church团队开发了一种新的RNA检测方法，名为BOLORAMIS(“"Barcoded Oligonucleotides Ligated On RNA Amplified for Multiplexed and parallel In Situ analyses”的缩写)，它克服了这个问题。

BOLORAMIS设计并使用了一种新型的DNA探针，可以直接结合其RNA靶标，并允许直接合成条形码DNA扩增子，可以通过荧光原位杂交(FISH)或原位测序进行可视化。与FISSEQ和其他方法相比，BOLORAMIS能够对不同种类的rna进行更高的特异性和敏感性的分析，适用于细胞和组织，并且可以高度复用。

这项研究发表在Nucleic Acids Research杂志上。

“有了BOLORAMIS，我们解决了空间转录组学技术面临的一些挑战。这为理解在正常和病理过程中分子网络的行为带来了帮助，并为研究新的药物靶点，发展临床诊断的原生环境组织提供了新观点，”Church说。

文章一作Songlei Liu解释说，“BOLORAMIS的优势在于其优化后的探针RNA footprint非常短，而且它并不需要在“逆转录酶”步骤首先生成RNA分子DNA拷贝，这会产生非特定的结果，而且很昂贵。”

在FISSEQ中，所有的RNA首先固定在适当的位置，然后整个RNA序列被复制到它的互补DNA序列(反转录)，然后这个互补DNA序列被环化并放大成更大的DNA球。这些可以在专门的荧光显微镜下测序并显示出来。“在BOLORAMIS实验中，通过绕过这一反转录步骤，直接放大RNA信号，我们减少了非特异性和假荧光信号，”Liu说。

BOLORAMIS探针像锁一样紧密结合在一个RNA分子中只有25个核苷酸的小序列上，具有高特异性，因此比其他靶向空间转录组学方法具有更小的印迹，从而提高了分辨率。

此外，探针包含条形码序列，为每个RNA目标物种分配一个独特的分子邮政编码。条形码“挂锁”探针与RNA杂交后，它们被环化，并在目标RNA的位置放大成一个微小的扩增子，而不需要进行反转录步骤。扩增子可以进行原位测序，或者使用第二种类型的探针进行高灵敏度的定位，这种探针被称为荧光原位杂交(FISH)探针，可以识别单个扩增子中包含的多个条形码。

该团队首先探索了BOLORAMIS在人类诱导多能干细胞(iPSCs)中的定量能力，方法是定量编码一系列转录因子的77个mRNA和具有基因调控其他功能的77个非编码RNA的水平。在一个癌细胞系中，BOLORAMIS能够定量地追踪一种称为MALAT1的非编码RNA的位置和运动，这种RNA在细胞核和细胞质两个不同的亚细胞位置之间穿梭。此外，研究人员证明BOLORAMIS可以在培养的人类大脑类器官这种更复杂的组织环境中的细胞中追踪具有高敏感性的普通RNA。

“对于我们来说，能够使用BOLORAMIS对许多RNA进行多重分析是至关重要的，我们希望新的探针设计能够做到这一点，”事实上，由合著者Andrew Pawlowski开发的一套软件可以预测任何基因序列的理想探针，然后这些探针可以被合成为用于特定目的的综合文库。团队已经在GitHub服务器上提供了这个工具。

“在未来的研究中，BOLORAMIS在复杂的人体组织和人类特有的类器官中的重要功能可能会给我们破译神经疾病相关的RNA方面带来优势，”文章另外一位通信作者Jenny Tam博士补充道。

“BOLORAMIS方法提供更高的效率和准确性，大大促进我们了解细胞和组织的能力组织影响正常生理以及复杂的疾病的能力，并因此促进新治疗和诊断的发展。”

（生物通：万纹）

原文标题：

Barcoded oligonucleotides ligated on RNA amplified for multiplexed and parallel in situ analyses