作者：俞晓峰  赛业生物首席科学家/中国区副总裁

    应用基因编辑小鼠模型研究基因的功能、揭示疾病致病机制过程，为药物研发的临床前研究，发挥了不可取代的作用。Cre-loxP位点特异性重组系统（简称Cre-loxP重组系统）的建立，为完善基因编辑小鼠模型的构建，进一步开展条件性靶基因功能的研究，提供了有效工具。回顾Cre-loxP重组系统在小鼠研究中的实际应用，研究者们认识到，对该技术应用中存在的某些风险与影响因素，给予充分了解与关注，将有助于提升靶基因编辑小鼠模型研究结果的准确性与可靠性。

文章亮点
一、Cre-loxP位点特异性重组系统应用基本原理
二、应用Cre-loxP位点特异性重组系统，实现小鼠条件性靶基因功能研究
三、不同Cre小鼠模型构建策略及方法特点
四、为什么要构建诱导性调控CreERT小鼠模型及其基本特征
五、Cre转基因小鼠模型中Cre插入位点鉴定的挑战与重要性
六、Cre-loxP位点重组系统应用中常见风险及影响因素
七、Cre-loxP位点特异性重组系统应用中的思考与建议

正文续前

七、Cre-loxP位点特异性重组系统应用中的思考与建议

1. Cre小鼠模型构建策略与方法不同，直接会影响到Cre-loxP重组系统作用的特异性及其潜在风险。
2. Cre表达特异性及效率等特征可能与其实际介导的重组切割活性不一致。
3. 需要在特定的靶细胞/组织中鉴定Cre作用活性，以确保其作用的靶向特异性
4. Cre-loxP重组系统与其他重组系统联合应用，增加细胞谱系示踪研究的特异性及有效性
5. 新型诱导性DD-cre小鼠模型的建立，成为未来Cre-loxP可诱导重组系统的补充
6. Cre小鼠构建策略建议性指导原则及需要考虑的因素概括

1. Cre小鼠模型构建策略与方法不同，直接会影响到Cre-loxP重组系统作用的特异性及其潜在风险。

      从起初传统随机插入研制技术构建的Cre小鼠品系，发现该技术方法自身存在许多不利因素开始，研究者们一直在不断探索研制更加合理的构建策略与方法。

      采用BAC介导的转基因技术目的，是为了提升Cre表达的准确特异性。因为BAC克隆更可能包含内源基因的所有调控元件相关序列。但是，某些基因表达调控的远端顺式调控元件或反式调控元件，有可能并不存在或包含于所选择的BAC克隆载体中，从而导致Cre表达无法真正反映内源细胞类型或组织特异性。

      最终，采取将Cre基因直接敲入到内源基因位点的策略，成为目前研制Cre小鼠模型的首选。一般认为，为了更加准确复制内源基因的表达特征，可选择通过取代内源基因编码序列的方式（比如CD19-Cre）； 然而，该定点敲入/敲除策略，有可能会影响/破坏内源基因表达。如果该基因为杂合缺失有表型，获得的杂合敲入Cre小鼠，可能会显示一定的表型。即使是杂合缺失无表型基因，单等位基因的破坏，在实际应用中，也建议避免使用纯合Cre小鼠。比如，CD19-Cre敲入/敲除小鼠模型，作为B细胞特异性Cre小鼠，虽然纯合小鼠无任何可见的表型，但由于Cre基因的敲入，使该小鼠缺乏B细胞B-1亚型，表现为血清IgM减少，对T细胞依赖抗原反应能力严重受损，无法形成供B细胞增殖与生长的脾脏生发中心。因此，如果应用纯合CD19-Cre小鼠，开展相关靶基因B细胞特异性敲除研究，自然很难以获得正确的实验结果。

      如果为了避免Cre定点敲入基因5‘端，可能引起的不良反应，建议选择将其敲入到内源基因编码区域外的3' 端非翻译区域（UTR）的方式 。然而，该定点敲入的构建策略，也存在一定的限制。由于多数基因转录后的调控过程多发生在其3’UTR区域，因此，在该区域的内源基因mRNA末端，添加相关附加基因序列的改变，存在潜在影响内源基因表达水平及其特征的可能性。

      所以，由于不同构建策略方法存在的局限性，有可能产生Cre潜在毒性或干扰相应内源靶基因的表达，导致Cre-loxP重组系统的非特异性生物学效应。为了避免实验研究中，出现对研究结果的错误解释，考虑用Cre小鼠，作为实验对照是有必要的。

2. Cre表达特异性及效率等特征可能与其实际介导的重组切割活性不一致。 

      报告小鼠已成为验证确定Cre活性与组织特异性等特征的非常有用工具。该种报告小鼠在其报告基因（如lacZ 或荧光蛋白）前插入两端都携带有loxP位点的终止序列，且这些报告系统多构建在特定所谓“安全”位点（比如最为常用的Rosa26位点）。

      有研究发现，科学家们可以通过报告小鼠的验证，获得非常完美的所谓Cre小鼠品系，而在实际应用中却发现，Cre-loxP重组系统的特异性靶基因作用，却远不能满足研究期望目标，表现为该Cre小鼠特异性靶基因切割活性非常不理想或是过分夸张。可能的原因解释之一，与Rosa26位点本身相对松散的染色质结构特性，从而增加了其与Cre蛋白结合敏感性等有关。

      其实Cre重组切割活性效率差异，不仅表现在Rosa26位点与实际靶基因位点之间，也表现在不同靶基因之间。提示，由Cre-loxP重组系统介导的切割作用的所谓“敏感性”或效率方面，在每个不同的靶基因作用位点上，都可能表现其独特性质与特征。比如，某Cre小鼠品系可能对某个靶基因位点的切割效率只有10%，但却可对另外靶基因位点，达短100% 重组切割作用。

      所以，实际应用中需要注意的是，虽然报告小鼠能提供Cre表达作用的某些特征，但该小鼠对实际靶基因的特异性重组切割作用效果，必须根据其对某个特定基因的单个细胞水平上的实际作用效果进行评估。

3. 需要在特定的靶细胞/组织中鉴定Cre作用活性，以确保其作用的靶向特异性。

      为了避免或降低某些Cre小鼠可能引起的明显非特异性脱靶作用，在应用Cre-loxP重组系统，进行靶基因编辑的实验研究中，需要设计合理的PCR鉴定引物组合，目的在于分析鉴别靶基因重组打靶的不同情况，比如，基因的杂合敲除、纯合敲除、未敲除，以及野生对照等可能的多种情况。

      一般情况下，应用小鼠尾巴DNA鉴定策略，进行所谓常规特异性基因型鉴定的时候，都不应该检测到靶基因被敲除的结果，除非该研究就是要特异性敲除皮肤上皮细胞的靶基因。这也是判断Cre小鼠是否具有生殖细胞敲除作用的关键。借助如此简单鉴定方法，能非常快速筛选出那些无非特异性切割作用的Cre小鼠品系，以确保实验研究的有效性与可靠性。而且，也可将靶细胞与对照细胞群，进行有效分离和检测，以明确特异性基因敲除的效率。

      判断Cre小鼠是否具有生殖系作用活性的另外一个简单方法，是将双性别的Cre小鼠分别与相应性别的报告基因小鼠交配，获得的阳性后代小鼠（F1），再与野生小鼠交配，分析其后代小鼠（F2）的报告基因表达情况，如果此F2小鼠报告基因的表达较其F1更加明显广泛，提示该Cre小鼠可能具有生殖系作用活性。

      在Cre-loxP重组系统实际应用中，如果是以提高Cre重组切割作用效率为目的，可采用先建立将靶基因单等位基因，在生殖细胞中敲除小鼠，再与floxed条件性打靶小鼠繁殖的策略。但必须清楚该策略的局限性，即不适合那些靶基因杂合敲除有表型的情况。另外，也不适合需要敲除两个基因以上的实验研究。

4.Cre-loxP重组系统与其他重组系统联合应用，增加细胞谱系示踪研究的特异性及有效性

      细胞谱系示踪的研究是借助Cre在特定靶细胞的激活，并通过相应报告基因的表达来显示。最为常见的报告基因为荧光蛋白，其表达的特异性与时空性完全依赖于特定Cre激活重组特性。因此，Cre/CreERT2小鼠与报告基因小鼠结合，常应用于细胞谱系示踪、行为学和镶嵌组织中敲除细胞分布等方面研究。

      为了改善细胞谱系示踪准确性及有效性，重要的是如何准确有效标记示踪特定细胞群及其后代中某类特殊细胞。如果报告基因在其他细胞群，发生非特异性表达，或者即使是正确的靶细胞群标记表达，但并非出现于研究所期望时间窗口期，都可能导致错误的实验研究结果。

      所谓Cre-loxP和Dre-rox双重组系统 , 即利用Cre和Dre双重组酶识别各自特定loxP 和rox位点，比如，分别构建靶基因（比如基因X和Y）相关的双重组酶小鼠，即X-Dre和Y-CrexERT2两种小鼠模型。而Y-CrexERT2小鼠的构建，则是通过在CreERT2载体中ERT2序列两端分别添加一个rox位点序列，从而构建基因X和Y特异性启动子介导的两种Cre小鼠品系。应用该双重组系统，结合报告基因小鼠模型（比如R26-LSL-tdTomato), 实现特定细胞群谱系示踪过程，满足X-Dre和Y-CrexERT2同时表达阳性的限定范围，使更加精准有效研究特定器官或组织特异性细胞谱系示踪成为可能。

      国内中科院周斌课题组应用该双重组系统，成功实现了靶基因在冠状动脉血管内皮细胞（Tie2-Dre和Wt1-CrexERT2），或脑血管内皮细胞（Tie-2和Mfsd2a-CrexERT2）的高效及特异性的基因敲除或过表达研究。

5.新型诱导性DD-cre小鼠模型的建立，成为未来Cre-loxP可诱导重组系统的补充

      TAM诱导性Cre-ERT2小鼠应用中的不足，比如，需要多次给药，相对较慢的诱导激活与抑制过程；以及TAM可能与小鼠内源性雌激素受体结合，导致相关副作用等，为进一步改善该系统，以及寻找更加有效诱导方法，具有其现实意义。 最近新型诱导性DD-Cre小鼠模型研制应用成功，也为Cre-loxP可诱导重组系统应用，提供了额外的选择。

      DD技术的基本原理，是基于来自人的FKBP12或细菌二氢叶酸还原酶 (ecDHFR) 的突变去稳定域（Destabilizing dormain-DD），与任何感兴趣的蛋白（比如Cre) 融合而建立。而合成的含FKBP12或ecDHFR标记的新型DD-相关蛋白，可导致蛋白酶降解过程。但如此蛋白降解破坏通路，可被抗生素甲氧苄啶（Trimethoprim ，TMP）所阻断。

      DD-Cre小鼠模型是将DD域与Cre基因融合，构建成去稳定化Cre重组酶系统 的DD-Cre小鼠，且其重组活性由抗生素TMP诱导调控，即DD-Cre激活重组作用为TMP依赖，从而实现体内Cre-loxP重组系统的位点特异性可诱导的靶基因编辑作用。

      TMP诱导物价格便宜、无毒性、诱导快速、可通过胎盘及血脑屏障，且在哺乳动物体内无内源靶点存在等优势，使TMP成为稳定DD标记蛋白的理想诱导物。 因此，体内应用TMP诱发蛋白稳定作用，有利于实验动物诱导剂快速传递，发挥其在神经系统等周围组织的高效扩散效应。

      有研究借助R26-CAG-tdTomato或R26 Ai9-tdTomato报告小鼠，应用不同浓度TMP（8～170 ug/g, 每天腹腔注射一次或连续七次) 诱导后24～48小时，其重组切割效果达高峰，且呈现剂量依赖效应。  研究表明，相对于CreERT2系统，TMP在体内诱导效果快，使DD-Cre系统成为具有吸引力与理想的广泛应用于神经遗传研究领域的工具。

      当然，如同其他方法一样，DD-Cre技术也可能出现一定程度的Cre 背景活性。且活性作用也会受到某些因素的影响，比如，DD融合蛋白的降解率，稳定性结合配体与合适亚细胞域融合的招募，以及DD表记对融合蛋白功能的干预等。

      最后，将Cre-loxP 位点特异性重组系统应用中，Cre小鼠构建策略建议性指导原则及需要考虑的因素概括如下：

（1）. 采用定点敲入基因打靶技术构建新型Cre小鼠品系；
（2）. 如果定点敲入基因位点不是杂合致死基因，建议将Cre定点敲入内源相关基因编码序列区域；
（3）. 如果可能的话，将报告基因也构建到新建立的floxed靶基因打靶小鼠；
（4）. Cre小鼠作为靶基因打靶研究的单独对照，以排除Cre小鼠本身引起的非特异性脱靶重组作用;
（5）. 如果靶基因不是杂合致死基因，可以先建立杂合生殖细胞基因敲除策略，以提高Cre打靶效率;
（6）. 设计合理的PCR特定鉴定引物组合，便于基因型鉴定分析靶基因敲除、野生和特异性靶基因打靶（flexed）等不同情况；（7）. 应用半合子或杂合Cre小鼠，以降低其可能引起的毒性及脱靶效应作用；
（8）. 如果有floxed小鼠作为附加实验对照，就更加完美；
（9）. 确定诱导剂TAM实际使用剂量预实验的重要性；
（10）. 了解特定Cre小鼠以前实际应用情况，包括其非特异性脱靶、生殖性重组活性、性别及遗传背景等影响因素；
（11）. 如果需要选择两个，或更多靶基因重组和/或靶基因编辑策略，建议应用突变类型的loxP序列，比如loxN、lox2271或lox511；以及其他类似的Dre-rox位点特异性重组系统等；
（12）. 考虑选择其他诱导调控系统，比如，借助抗生素甲氧苄啶（TMP）诱导的DD-Cre新型可调控系统。
（13）. 条件性Floxed小鼠靶基因2 x loxP间DNA长度、染色体位置、表观遗传修饰、生殖细胞转录易接近程度等也可成为Cre作用效率的影响因素。

（全文完）

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技术连载：Cre-loxP位点特异性重组系统在小鼠条件性靶基因功能研究中的应用

技术连载之2：Cre-loxP位点特异性重组系统在小鼠条件性靶基因功能研究中的应用