密苏里大学(MU)、佐治亚理工学院和哈佛大学的研究人员开发出一种治疗胰岛素依赖型糖尿病(T1D)的移植疗法，使用了一种含有可以促进免疫耐受的SA-FasL蛋白质的新型生物材料——这种蛋白质固定在凝胶微珠的表面，可支持胰岛细胞移植后的生存，不需要终身免疫抑制。这样移植受体就不必长期服用免疫抑制药物来防止排斥反应。

在马萨诸塞州总医院(MGH)进行的一项临床前研究中，研究人员成功地在T1D非人灵长类动物模型中测试了这种生物材料。他们的结果证实，在接受含有胰岛的生物凝胶移植的动物中，血糖和移植物存活率得到了良好的控制，持续时间超过6个月。当研究人员移除移植物时，动物的血糖水平再次升高。文章发表在新一期的《SCIENCE ADVANCES》中。

背景

I型糖尿病 (T1D) 是由胰岛 β 细胞的自身免疫性破坏引起的。胰岛移植可恢复 T1D 患者的 β 细胞量，并有可能预防和逆转糖尿病并发症。但胰岛移植受者必须在余生中使用免疫抑制药物，这些药物不仅对受者和移植 β 细胞有毒而且可能诱导外周胰岛素抵抗。因此，无需免疫抑制的耐受性方案的开发将促进胰岛移植作为 T1D 治疗的广泛应用。

免疫耐受性在 60 多年前首次在小动物模型中得到证实。多年来对各种耐受诱导策略的研究尚未转化成临床有效的方案。迄今为止，混合造血嵌合体（Mixed hematopoietic chimerism）是实现临床耐受的唯一方案，但仅限于少数患者。

Fas 受体/Fas 配体 (FasL) 通路在激活诱导的细胞死亡、和对自身抗原的耐受中发挥着至关重要的作用。已在实验动物模型中证实 FasL 基因治疗能减轻移植受体的同种异体免疫反应。然而，FasL 在靶组织中持续异位表达的安全性并不确定、FasL 的可溶性表达形式与膜结合形式具有相反特性、基因治疗的技术和监管挑战都严重限制了其临床适用性。

为了研究 FasL 作为免疫调节剂的潜力，研究人员构建了一种由 FasL 细胞外结构域与核心链霉亲和素蛋白 (SA) 组成的嵌合蛋白SA-FasL。SA-FasL 作为多聚体存在，对表达 Fas 的免疫细胞具有强大的诱导凋亡活性，并且缺乏其天然细胞外结构域中存在的基质金属蛋白酶可切割位点。在同种异体移植小鼠模型中，在没有慢性免疫抑制的情况下，表面经过化学修饰呈现 SA-FasL 蛋白的胰岛在肾包膜下能够无限期存活。然而，对胰岛表面进行化学修饰以呈现 SA-FasL 的要求限制了这种方法在临床中的应用。

研究主题

因此，研究人员新设计了一种基于聚乙二醇（PEG）的合成水凝胶微球（微凝胶），其表面附有生物活性的 SA-FasL。在雷帕霉素的短暂掩护下，将表面附有 SA-FasL 的微凝胶与未修饰的同种异体胰岛共同移植到糖尿病小鼠中，实现了长期植入和功能恢复。受体对供体抗原产生正常的全身反应，这意味着移植物的免疫特权， FoxP3 + T regs有助于移植物的接受，因为它们的缺失会导致移植物迅速排斥。这种基于生物材料的策略提供了现成的免疫调节能力，而无需修改供体胰岛，从而增加了其临床相关性和潜在临床适用性的广度SA-FasL 微凝胶促进胰岛同种异体移植物的持续存活和功能

结果：一些细节
使用门静脉内给药的方式将胰岛置于肝脏内，是唯一证明对持续移植功能有效的部位。然而，将胰岛注入门静脉系统会触发血小板、凝血因子和补体系统的激活，从而导致胰岛的显著急性损失。网膜（omentum）是胰岛和免疫调节微凝胶共存的理想替代部位，提供了一个容纳材料的宽敞部位，丰富的毛细血管床通道，以及能够将胰岛素输送到门静脉循环中。研究人员根据迈阿密方案评估了 SA-FasL 微凝胶对移植到网膜的移植同种异体胰岛的持续存活和功能。

此前已证明，在雷帕霉素的短暂掩护下，将SA-FasL 微凝胶与同种异体胰岛共同移植能够使小鼠移植物无限期存活 。由于非人类灵长类和啮齿动物之间的代谢和药理学动力学存在差异，在非人灵长类实验中雷帕霉素瞬态方案是通过结合以前临床报告得出的毒性知识和在 NHP 中实现移植物保护的可耐受水平的经验。之前的研究表明，雷帕霉素单一疗法在同种异体 NHP 模型中即使水平 >50 ng/ml 也不能预防胰岛移植排斥。本实验中，生物素化的 PEG 微凝胶（直径 150 μm）通过微流体聚合合成并用 SA-FasL 功能化，这种合成生物材料为 SA-FasL 的受控呈现提供了一个高度可重现的平台。四个糖尿病NHP模型在网膜表面移植了同种异体胰岛 [14,800 至 18,700 胰岛当量 (IEQ)/kg]和SA-FasL 微凝胶（150,000 至 200,000 个微凝胶，提供 0.2 mg SA-FasL）混合物。使用 3 个月的雷帕霉素单药治疗。停药 2 周后，雷帕霉素水平已无法检测到。另外三个糖尿病 NHPs作为对照组，在类似的雷帕霉素方案下，将同种异体胰岛 (19,300 至 20,000 IEQ/kg) 与未经 SA-FasL 蛋白修饰的 PEG 微凝胶共同移植到网膜中。

胰岛移植后，所有接受 SA-FasL 呈递微凝胶的动物均实现并维持即时血糖控制，观察期 >134、>170、>177 和 >188 天。相比之下，接受相同雷帕霉素方案并具有相当的雷帕霉素血浆水平但没有 SA-FasL 的对照组仅维持了 21、27 和 35 天的血糖控制。平均存活时间为 27.7 天。由于 2019 新冠疫情实验终止。

在移植前和移植后的多个时间点通过流式细胞术评估针对供体 MHC 抗原的 IgG 抗体的产生。随着时间的推移，在 SA-FasL 微凝胶受体中未检测到针对 MHC I 类或 MHC II 类 的阳性供体特异性抗体。相比之下，移植后 1 个月，对照微凝胶NHPs 血清中MHC II 类抗体（P = 0.0326）而非I 类抗体（ P = 0.3292）的滴度显著增加。酶联免疫斑点 (ELISpot) 测定表明，对于 SA-FasL 微凝胶或微凝胶，移植前和移植后时间点之间的干扰素-γ (IFN-γ) 分泌没有差异。多重免疫珠测定显示，SA-FasL 微凝胶和微凝胶受试者血清中促炎和抗炎细胞因子和趋化因子的移植前和移植后水平没有显着差异。最后，在早期时间点，SA-FasL 微凝胶动物的血清中未检测到针对 SA-FasL 蛋白的抗体，但在移植后约 2 周时出现。大多数抗体是针对 SA-FasL 蛋白的 SA 结构域的。这些结果表明，针对 SA-FasL 的抗体在移植后约 2 周出现，主要针对嵌合蛋白的 SA 部分。这种抗体的存在不会对维持同种异体胰岛移植存活方面的功效产生负面影响。

讨论

在没有慢性免疫抑制的情况下实现同种异体移植物的无限期存活仍然是临床移植中难以实现的目标。特别是对于胰岛移植，考虑到平衡 β 细胞功能恢复和免疫抑制毒性的微妙风险/益处考虑，可靠和安全的耐受性方案可以扩大胰岛移植对 T1D 的治疗应用。本实验中作者证明了与同种异体胰岛共同移植的 SA-FasL 呈递微凝胶可有效维持糖尿病 NHP 的长期（> 6 个月）存活和出色的血糖控制，而无需慢性免疫抑制。这些受试者表现出与糖尿病前期状态相当的葡萄糖反应性胰岛素分泌和 C 肽水平。与此形成鲜明对比的是，与没有 SA-FasL 的微凝胶共同移植的对照动物急性排斥胰岛移植物。持续存活与移植部位的 FoxP3 +（T regs标志物）细胞数量增加有关，而各种免疫细胞群的全身频率没有可检测到的变化。此外，接受 SA-FasL 呈递微凝胶的 NHP 未显示移植前和移植后 IFN-γ 分泌细胞数量和抗供体 MHC 抗体之间的变化。相比之下，接受对照微凝胶的受试者产生了针对供体 MHC 分子的抗体，并表现出对供体和第三方抗原的CD8 + T 细胞增殖反应增加。移植部位的 FoxP3 +细胞数量增加和全身 T 细胞频率和对供体抗原的反应不变。表明 SA-FasL 赋予移植物局部耐受性。

接受同种异体胰岛和 SA-FasL 微凝胶的受试动物表现出正常的肝肾代谢功能和器官组织学，并继续增加体重，表明免疫调节生物材料具有可接受的安全性。没有观察到 FasL 毒性，可能归因于 SA-FasL 的形式和位于局部。

尽管接受与 SA-FasL 微凝胶共同移植的同种异体胰岛的糖尿病 NHP 显示出长期的胰岛接受和正常的空腹血糖控制，但他们没有实现胰岛素独立。尽管如此，与移植前糖尿病水平相比，EIR 降低了 80% 至 90%，以控制餐后血糖。由于 NHP 同种异体胰岛移植复杂且要求很高，因此未实现胰岛素独立的想法并不意外，并且单供体胰岛移植（如本研究中所做的那样）通常代表边缘胰岛肿块。同样，来自单个供体的胰岛质量通常不足以在人类胰岛移植中恢复完全的血糖正常。45 )。同样的问题也适用于同种异体胰岛 NHP 移植。持续的 C 肽水平、改善的血糖控制和定期 IVGTT 的结果证明了稳定和强大的胰岛功能。值得注意的是，观察到四个接受 SA-FasL 微凝胶的同种异体胰岛受体中有三个的胰岛移植功能逐渐改善，一个受体在研究结束时几乎实现了稳定的胰岛素独立性，表明该方案的有效性和稳定性。

MHC 分型表明所有供体-受体对总体上是不相容的。然而，对于 SA-FasL 微凝胶和对照组，每组只有一对 MHC 完全不匹配的动物，而所有其他对都是 Mafa-A 或 Mafa-B 单倍体或 MHC 单倍体，因为要实现的动物选择有限MHC 完全不匹配。尽管移植后 6 个月完全不匹配的受体 M518 的 IVGTT 数据显示葡萄糖处理比幼稚时更好，但与同龄人相比，该动物和对照组中完全不匹配的受体 M517 在移植后的非空腹血糖控制效果较差在他们各自的组里。这提出了一个问题，即在完全 MHC 不匹配的情况下，是否需要修改呈递 SA-FasL 的微凝胶与胰岛的比例。我们知道胰岛 β 细胞在正常生理条件下不表达 II 类抗原，因此无法通过 CD4 直接识别+ T 细胞 ( 46 , 47 )。这可能是目前临床胰岛移植不实践 MHC 匹配和新完成的两个 3 期临床胰岛移植联盟临床试验的原因之一 ( 45 , 48) 也没有提供这方面的见解。许多因素，如动物饮食习惯、移植前胰岛素需求、移植胰岛的质量和数量、基线供体特异性抗 HLA 抗体等，都有助于我们 NHP 模型中的移植后代谢结果，但 MHC 匹配与代谢结果值得进一步研究。此外，即使 MHC 完全匹配，移植物也会因为 NHP 同种异体移植模型中的次要抗原而被排斥。然而，SA-FasL 微凝胶的影响仍然很明显，因为两只对照动物是 MHC 半相合但在移植后约 1 个月仍排斥移植物。

对移植的同种异体胰岛的免疫反应涉及同种异体和自身反应途径。在抗原识别和激活后，自身和同种异体反应性 T 细胞在其表面表达 Fas，并对 Fas/FasL 相互作用诱导的细胞凋亡敏感。因此，FasL 有可能用作免疫调节剂以在胰岛移植的情况下消除这些 T 效应子。作者的策略是使用先进的合成材料以可控和持续的方式在移植物微环境中局部提供 FasL。与 FasL 基因治疗相比，这是一个独特的优势，因为 FasL 的不受控制的、连续的表达可能会产生意想不到的后果，它具有多效性活性和可能受靶组织差异调节的各种表达模式。使用微凝胶局部呈现 SA-FasL 还克服了与使用基因疗法在靶组织中异位表达 FasL 相关的并发症和针对 Fas 的激动性抗体报道的潜在毒性。最后，SA-FasL 工程微凝胶为更广泛的临床应用提供了现成产品的灵活性，因为这些免疫调节材料可以在移植时制备，并与胰岛简单混合进行递送，无需封装或化学处理修饰胰岛以呈递蛋白质。

本研究的局限性：NHP 同种异体胰岛移植研究仅包括少数受试者，限制了统计学比较，并且结果可能不能代表更大的受试者队列。尽管STZ诱导的 NHP 糖尿病模型为同种异体胰岛移植提供了严格的测试，但它不涉及自身免疫，这是在人类 T1D 环境中移植时的重要考虑因素。最后，小型灵长类动物的网膜是一种薄薄的游丝状血管化膜，不含脂肪且很厚。人类网膜通常与灵长类动物不同。尽管初步研究支持网膜作为人类门静脉内移植的替代方法，需要进一步的研究来确定其对临床胰岛移植的有效性。

作者的补充

“我们的策略是创造一个局部免疫特权环境，使胰岛在没有长期免疫抑制的情况下存活下来，并在6个月的研究期间实现了所有糖尿病非人类灵长类动物模型的血糖控制。”第一作者、MGH的副免疫学家、哈佛医学院外科助理教授Ji Lei医学博士说。“我们相信，在没有抗排斥药物的情况下，我们的方法可以使移植细胞存活并控制糖尿病超过6个月，因为在研究结束时，手术切除移植组织会使所有动物迅速恢复糖尿病状态。”该研究小组目前正计划进行临床试验。

作者解释说，T1D源于自身免疫对胰岛细胞的破坏。“免疫系统是一个严格控制的防御机制，确保个人在充满感染的环境中健康，”哈瓦尔·Shirwan医学博士说，他是密苏里大学医学院儿童健康、分子微生物学和免疫学教授，也是该研究的主要作者之一。当免疫系统将胰腺中产生胰岛素的细胞误认为感染并摧毁它们时，就会发生1型糖尿病。通常情况下，一旦感知到的危险或威胁被消除，免疫系统的指挥和控制机制就会启动，消除任何流氓细胞。然而，如果这一机制失败，就会出现1型糖尿病等疾病。”糖尿病影响身体产生或使用激素胰岛素的能力，胰岛素通常有助于调节体内对血糖的利用。T1D患者不能制造胰岛素，因此无法控制血糖水平。这种失控还可能导致危及生命的并发症，如心脏病、肾脏损伤和眼睛损伤。

终生每日胰岛素治疗是T1D患者的标准治疗方法，因此胰岛移植治疗可以替代丢失的胰岛细胞是一个有吸引力的选择。然而，这种策略要求患者终生服用免疫抑制药物以防止排斥反应。“这些免疫抑制疗法对患者是有毒的，所以该领域的主要目标是开发一种方法，使你能够将这种移植物植入体内，并使其在没有慢性免疫抑制的情况下发挥作用。”乔治亚理工学院联合研究负责人Andrés García博士说。 

在过去的二十年里，Shirwan和Esma Yolcu医学博士瞄准了一种叫做细胞凋亡的机制，通过在胰岛表面附着一种叫做FasL的分子来摧毁“流氓”免疫细胞，防止其引起糖尿病或移植胰岛的排斥。“当一种称为FasL的分子与流氓免疫细胞上的另一种称为Fas的分子相互作用时，就会发生一种凋亡，并导致它们死亡，”Yolcu说。“我们的团队开创了一项技术，使一种新型FasL的生产成为可能，并将其呈现在移植的胰岛细胞或微凝胶上，以防止流氓细胞的排斥。”

研究人员此前曾在糖尿病小鼠身上测试过这种方法。他们写道:“我们之前证明，在雷帕霉素的瞬时掩护下，SA-FasL微凝胶与异体胰岛共移植，可以在小鼠中无限期存活。”

García，补充说，“免疫抑制对患者来说是一个重大问题，但在我们之前的工作中，我们表明这种生物材料，这种微凝胶，是一种有效的免疫调节分子，可以诱导对新细胞的永久接受。但这项研究是在鼠身上进行的，鼠的免疫系统与人类的非常不同。在走向临床应用的过程中，你真的需要在大型动物模型中测试这种策略。

在他们最新报道的研究中，研究人员将这种材料移植到一个非人类的灵长类糖尿病模型中。在这些实验中，微凝胶被移植到动物大网膜中，大网膜是一层脂肪组织的褶皱，悬挂在胃上，覆盖着肠道。他们进一步解释说:“在这里，我们研究了SA-FasL微凝胶技术在链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病NHP模型中的免疫调节潜力，在该模型中，异体胰岛和SA-FasL微凝胶共移植到大网膜中。”移植后，受体动物使用单一的抗排斥药物(雷帕霉素)治疗三个月。结果显示，SA-FasL呈现的微凝胶与异体胰岛共移植有效地维持了长期(>6个月)的生存，并在糖尿病NHPs中“极佳的血糖控制”，没有慢性免疫抑制。“这些受试者表现出对葡萄糖敏感的胰岛素分泌和c肽水平，与糖尿病前期状态相当。”“与之形成鲜明对比的是，对照组动物与不含SA-FasL的微凝胶共移植的胰岛移植发生急性排斥反应。”Yolcu进一步评论说:“在产生胰岛素的胰岛细胞移植后，流氓细胞动员到移植物上进行破坏，但被FasL与其表面的Fas结合而消除。”

这种新方法可能使受体不再需要终生使用免疫抑制药物进行治疗。免疫抑制药物会抑制免疫系统寻找和摧毁外来物的能力，如进入体内的器官或细胞移植。Shirwan说:“免疫抑制药物的主要问题是它们不是特异性的，所以它们会有很多副作用，比如癌症发病率很高。”“所以，利用我们的技术，我们找到了一种方法，我们可以调节或训练免疫系统接受，而不是排斥这些移植细胞。”

由于这种生物材料可以在实验室中制造出来，并运送到任何地方，这种新的治疗方法基本上是现成的。现在这种策略已经被证明对非人灵长类动物有效，García和他的合作者相信，I型糖尿病患者可能会有一个强大的新治疗选择。García是授权这项技术的公司ittolerance的联合创始人，该公司已经在与美国食品和药物管理局讨论人体临床试验的计划。

通讯作者García是一个20人研究小组的成员，他说:“我们非常激动，这是非常令人兴奋的，这对对抗I型糖尿病的人来说是有希望的结果。”为了开发商业产品，密歇根大学的研究人员与García和乔治亚理工大学的团队合作，将FasL附着在微凝胶的表面，以便在小动物模型中进行有效性验证研究。然后，他们与Lei以及共同通讯作者James F. Markmann(医学博士，MGH移植外科主任和移植中心临床操作主任)一起，评估了FasL微凝胶技术在大型动物模型中的疗效。

Lei也是MGH人体胰岛/细胞处理特殊服务cGMP设施的主任，他指出，胰岛移植到大网膜比目前临床移植到肝脏的方法有几个优势。他解释说:“与肝脏不同，网膜是一种非生命器官，如果遇到不希望的并发症，可以移除网膜。”“因此，大网膜是治疗糖尿病的一个更安全的移植部位，可能特别适合干细胞来源的β细胞和生物工程细胞。”

Markmann进一步指出，非人灵长类动物研究是一个高度相关的临床前动物模型。他说:“这种局部免疫调节策略在没有长期免疫抑制的情况下取得了成功，并显示出在1型糖尿病患者中应用的巨大潜力。”

作者指出，与潜在的基因治疗方法相比，他们使用移植物局部交付FasL的方法也有优势。他们指出:“我们的策略是使用先进的合成材料，以一种可控和持续的方式在局部微环境中交付FasL。”“与FasL基因治疗相比，这是一个独特的优势，因为FasL具有多活性和可能被靶组织差异调节的多种表达模式，不受控制的连续表达可能会产生意想不到的后果。”此外,他们指出,“SA-FasL微凝胶提供现成的产品，具有更广泛的临床应用的灵活性，这些免疫调节材料可以准备移植的时候与胰岛简单混合，不需要封装或化学修饰胰岛的蛋白质。”