哪些技术将被RNA医学的领导者广泛采用?如mRNA药物领域的Moderna、BioNtech、CureVac, ASO领域的Ionis Pharmaceuticals、Sarepta等，siRNA领域的Alnylam、Dicerna、Arrowhead, saRNA领域的MiNA Therapeutics，Zhongmei Ruikang等，以及其他各种RNA治疗公司。

随着新冠病毒mRNA疫苗的成功，RNA药物进入了快速开发阶段。

在全球范围内，RNA疗法为各国的研究人员提供了一个独特的机会，以扩大药物开发目标的范围。

在发展过程中有很多不同类型的RNA治疗，主要包括反义寡核苷酸(ASO)、小干扰核酸(siRNA)、微RNA (miRNA)、信使RNA (mRNA)、适配体(核酸适配体)等。

作为一种新型的药物治疗，它可以选择性作用于传统药物分子无法靶向的蛋白质和基因。RNA核酸药物已被用于许多不同的疾病。

尽管RNA治疗的研发取得了惊人的进展，但仍有许多问题和挑战需要克服，如RNA不稳定性高，体内传递效率低，宿主细胞免疫原性等。

RNA分子直接用于药物或靶向RNA小分子两种治疗方式。

RNA药物可以利用内源性调控机制，特异性调控其靶标。

RNA药物必须通过细胞膜，具有与细胞内靶点结合调节基因表达的能力，从而实现对相关蛋白表达的调控。

各种RNA疗法的基础

蛋白表达水平的检测是药理学和药效学研究的一个重要方面。

目前，对不同基质中分泌蛋白和内源性蛋白的定量分析技术多种多样，如ELISA技术、LC-MS技术、Western Blot技术等。

也有一些创新技术逐渐被主流核酸制药公司采用。

这篇文章就来看看核酸药物龙头在研发中都用了哪些技术来解决蛋白质分析问题。

1 、Moderna在临床前动物模型中的蛋白表达定量技术

Moderna目前正在开发一种治疗丙酸血症(PA)的临床I期mRNA疗法，mRNA-3927。

临床前小鼠动物模型研究表明，双RNA治疗可以恢复代谢功能。

丙酸血症是由线粒体酶丙酰辅酶A羧化酶(PCC)缺乏引起的，该酶由6个α亚基(PCCA)和6个β亚基(PCCB)组成。

利用编码人类PCCA和载于生物可降解脂质纳米粒(LNPs)的PCCB的双mRNA组合，在肝脏中产生了一种功能性PCC酶。

双mRNA编码的蛋白比单mRNA编码的蛋白具有更高的PCC酶活性。

2、Arcturus Therapeutics定量检测治疗组织中hOTC的表达

Arcturus Therapeutics的临床期mRNA治疗ARCT-810用于治疗鸟氨酸转鹿酰胺酶缺乏症(OTCD)。

该疾病是尿素循环紊乱中最常见的遗传性代谢性疾病，OTC基因突变可引起高氨血症发作。

脂质纳米颗粒(LNP)负载OTC mRNA (LUNAR-OTC mRNA)利用专有的脂质药物介导技术，安全有效地将OTC mRNA传递到肝细胞，从而使患者自身的肝细胞自然产生具有功能的OCT酶。

在临床前小鼠模型研究中，通过测定经口服OTC-mRNA药物治疗的小鼠肝脏和血浆中OTC酶活性和蛋白表达，来反映LUNAR-OTC mRNA药物对小鼠模型的疗效。

人鸟氨酸转氨基甲酸酯酶(hOTC)在小鼠肝脏中的蛋白表达。

采用全自动毛细管Digital Western (Jess Simple Western)系统定量检测小鼠肝脏中hOTC蛋白的表达，以重组蛋白为校准曲线进行定量。

使用抗人OTC抗体，4个不断增加的剂量组观察到明显的剂量反应，未治疗OTC缺乏组和未治疗野生型组均未检测到hOTC蛋白。

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a-c是双RNA共转染与hPCCA或hPCCB mRNA单转染的数据比较。a和d为酶活性评估，图b和c为使用毛细管Digital Western技术定量检测患者成纤维细胞中PCCA和PCCB蛋白表达。

Science旗下期刊:ASO抑制RBM20可改善心力衰竭功能

保留射血分数(HFpEF)心力衰竭是常见和致命的，到目前为止，还没有很好的靶向药物。

其病因之一是心室充盈受损，而针对心脏拼接因子RBM20使用反义寡核苷酸(ASOs)可改善其功能。

在壁硬度增加的成年小鼠中，每周给药2个月的ASO增加了肌动蛋白亚型的顺应性表达并改善了心功能。

在人类工程心脏组织中验证结果显示，RBM20表达在ASO治疗3周内下调至低于50%，在没有心脏病理的情况下产生自适应松弛动力学。

研究表明抗RBM20 ASO在人HFpEF治疗中是一种强大的心脏剪接调节剂。

注射RBM20 ASO可有效抑制RBM20在小鼠心脏的表达。

(B)为小鼠实验设计，

(C) PBS或ASO处理野生型(WT)和N2B敲除(KO)小鼠心脏组织中RBM20 mRNA表达

(D、E)采用毛细管Digital Western法检测相应RBM20蛋白表达丰度。

在mRNA和蛋白表达的分子水平上，RBM20的表达丰度下调50%以上。

全自动毛细管Digital Western技术是核酸药物开发中蛋白质表达定量的先进工具

以上三家Moderna、Arcturus Therapeutics和Ionis Pharmaceuticals的案例只是Digital Western的代表性案例，该技术已被RNA药物领域的领导者广泛采用。

如mRNA药物领域的Moderna、BioNtech、CureVac, ASO领域的Ionis Pharmaceuticals、Sarepta等，siRNA领域的Alnylam、Dicerna、Arrowhead, saRNA领域的MiNA Therapeutics，中美瑞康等，以及其他各种RNA治疗公司。

全自动毛细管 Digital Western技术是一种创新的毛细管电泳免疫技术，它将Western Blot技术和ELISA技术结合在一起，可以利用微量组织样本实现内源性蛋白的精确相对和绝对定量。

作为一种创新的生物分析方法，它具有传统Western Blot蛋白分子量可视化的优点，具有ELISA和MS技术更准确的定性、准确的定量性能，灵敏度和精密度满足高标准生物分析的要求。

RNA治疗应用的技术优势

1) Digital Western技术适用于体外和体内各种RNA治疗模型中目的蛋白表达的定量分析，用于细胞系、类器官模型、小鼠动物模型和非人灵长类动物模型的关键蛋白分析。

2) Digital Western技术对样本量的要求仅为传统Western Blot的十分之一，只需3 μL样品即可实现多种蛋白表达检测，特别适用于微量珍贵样品的蛋白分析。

3) Digital Western精确定量检测，传统Western Blot只能满足样品的半定量要求，重复性较差。

RNA治疗的某些靶蛋白表达与临床治疗效果相关，可作为替代生物标志物建立剂量-反应关系。

目的蛋白分析的检测标准有待提高，技术有待严格验证，而Digital Western可以满足这些需求。

4)符合RNA治疗自动化标准化和效率化的需求，面对激烈的行业竞争，有必要提高研发效率。

Digital Western是完全自动化和标准化的，软件符合FDA 21 CFR Part 11合规要求。

该系统在3小时内完成一批蛋白分析，比传统的Western Blot和ELISA更快，大大提高了实验效率，降低了人工成本。