一项包括神户大学、东京大学和东北大学的研究人员的合作，已经成功地识别并破坏了酵母中的基因毕赤酵母属pastoris(*1)以增加其分泌产生的有用蛋白质(*2)。通过一系列的过程，包括结合基因破坏，然后连续培养(*3)产生的多个破坏菌株，他们发展p . pastoris能够高产出有用蛋白质的菌株。人们希望这一发现将导致技术的发展，以提高生物医学抗体和工业酶的蛋白质生产，以及其他应用。

来自神户大学的合作研究包括工程生物学研究中心的项目副教授ITO Yoichiro和副教授ISHII Jun，以及科学、技术和创新研究生院的KONDO Akihiko教授。

要点  

• 研究人员使用多井格式的高通量分析来识别p . pastoris基因中断可能会增加有用蛋白质的分泌量。

• 当对已识别基因的多次破坏被结合时，有用蛋白质的分泌量可能会增加。

• 这些被多次破坏的基因被发现会增加分泌量，即使有用的蛋白质或其表达不同。

• 通过培养这些多基因断裂菌株(即有用蛋白生产菌株)，研究人员成功地增加了有用蛋白的分泌量。

研究背景
近年来，世界各地都在尝试通过酵母菌分泌生产酶(用于工业)和抗体(用于生物医学)的蛋白质p . pastoris(syn。Komagataella phaffii)． 然而，各种困难阻碍了这一进程，例如，p . pastoris对某些靶蛋白的生产速率较低。有鉴于此，研究人员提出了以下方法(图1)，旨在提高难分泌蛋白(或分泌量低的蛋白)的高产率p . pastoris: 1。通过筛选随机基因组破坏菌株库来识别有效的基因破坏，2。对已识别的基因进行多次破坏，3。通过系列培养提高分泌量。

研究方法
随机基因组破坏库的创建和筛选:
为了在随机基因组破坏文库中找到有效的基因破坏，研究人员首先开发了一种简单的方法来评估各种转基因菌株产生目的蛋白的能力(图2)。抗溶菌酶单链可变片段(scFv)抗体(*5)很难在其中分泌p . pastoris． 研究人员以scFv为模型蛋白，建立了高通量的多孔筛选体系，便于大量突变株对scFv的分泌情况进行评估。他们创造了一个随机的基因组破坏库p . pastoris使用上述方法，他们能够评估超过19000个不同菌株的scFv产量。由此，他们成功地确定了基因破坏可以增加scFv产生的6个基因(6种基因破坏中有5种是新的)(图3)。

巧合的是，在这次筛选过程中，他们还发现了一个分泌信号序列(*6)中显著增加scFv分泌的突变(图3a中的79G10)(参考文献:Ito et al.，避免信号突变进入细胞内的蛋白质降解途径增加了蛋白质的分泌毕赤酵母属pastoris，微生物。Biotechnol 2022)。这是1个氨基酸突变(V50A)在酿酒酵母-衍生的(*7)MFα信号肽。

在识别出的有用基因中结合多个中断
研究人员继续在单链抗体产生株中破坏已鉴定的基因(通过上述步骤获得)p . pastoris揭示了基因破坏的积累导致了蛋白质产量的增加。与亲本菌株相比，对4个已鉴定基因进行多次中断的菌株显示了5倍的生产力提高(图4)。此外，研究人员表明，对这些基因进行(多次)中断具有相同的效果，不仅在筛选中使用的scFv生产菌株中，而且在β-葡萄糖苷酶(*8)生产菌株和与筛选中使用的启动子不同的scFv菌株中(图4)。

(多)基因断裂菌株的连续培养
在每个基因都有(多次)中断的菌株中，他们发现p . pastoris细胞增殖随着基因破坏的积累而下降(图4)。为了恢复这些菌株的增殖速度，他们重复了50次以上的培养周期，使酵母每次都能在新鲜培养基中生长。这叫做适应性实验室进化(ALE)。利用这种技术，研究人员成功地恢复了大多数被破坏菌株的细胞增殖，并提高了它们的scFv生产力(图5)。

通过上面描述的三个步骤(1。2.随机基因组破坏库的创建和筛选;3.结合已识别的有用基因的多个中断;培养具有(多基因断裂(s))的菌株，研究人员成功地增加了目标蛋白的产量。这可以作为一种方法，开发新的寄主菌株，以增加生产有用的蛋白质p . pastoris．

进一步的研究
利用从这项研究中获得的洞察力，研究人员计划开发p . pastoris难以表达的目标蛋白的更高生产力的染色。

文章标题

A streamlined strain engineering workflow with genome-wide screening detects enhanced protein secretion in Komagataella phaffii