简介
生物种群经历着不断的环境变化，特别是在全球变暖的背景下。自前工业化时代以来，全球平均气温已经上升了1℃(1)预计在21世纪将增加0.4°到4.8°C(2).此外，气候变化与热浪频率和长度的增加有关(三,4)包括海洋热浪。迄今为止，最重要的海洋热浪持续时间为10至380天，最高强度为海面温度以上3.5至9.5℃(5).由于持续的气候变化，海洋热浪的频率已经增加了20多倍。据预测，如果气候持续变暖，特别是全球气温上升3°C或更高，这些热浪的频率、长度和强度都将增加(6).因此，有机体生长的热上限预计将经历更大的选择压力(7).目前尚不清楚自适应进化是否能迅速扩展热上限(7,8)对热浪作出反应，但坚硬的生理边界可能会限制热浪的延伸(9,10).这些边界可能是由温度对生物体的影响引起的，特别是对蛋白质变性和膜流动性的影响，而单步适应性突变可能无法克服这些影响。
当面临严重的环境压力时，种群可以通过进化适应来避免灭绝，这种现象被称为进化拯救(11).进化救援的成功与否取决于压力源的严重程度、发生的速度以及种群规模(11–17).在面临逐渐变化的大量人口中，成功的救援更有可能(13–16).温度变化是重要的压力源，因为温度影响生物体的生长和繁殖，它们的生化反应进行得有多快，以及它们的蛋白质功能如何(18).例如，超过一个称为融化温度的温度阈值，蛋白质就会失去它们的三级结构和功能，这就是为什么蛋白质折叠的生物物理学限制了生物体生存的温度范围(19).耐热蛋白质倾向于富含带电和疏水残基，后者优先出现在蛋白质核心，以减少溶剂暴露(20).对高温的适应已经在许多生物体中进行了研究，包括在野外，例如在水蚤和矢车菊中，在实验室里，通过实验进化出果蝇、鱼类和细菌大肠杆菌(1,10,18,21–29).细菌具有种群大、世代短、基因组小等特点，是研究高温快速适应及其基因组基础的理想候选菌。自适应进化允许E、 大肠杆菌在高于其最佳生长温度的温度下提高存活率(28,29).它能迅速适应高温(27)但是，适应超过其祖先的温度上限的温度的基因组学基础以及它们最终的失败是未知的(30).
为了研究高耐热性的进化潜力，确定其极限，并确定其基因组基础，我们使用了一种冷适应（嗜冷）细菌。来自冷适应环境的有机体研究较少，但在生态学上很重要。它们是地球上生物量最大的部分，因此是全球生物地球化学循环的中心(31).冷适应细菌比中温细菌有更大的热安全边际，也就是说，它们的生存温度比它们的最高耐热性低几度。此外，虽然中温细菌最快的生长速度接近其环境温度，但适应冷环境的细菌在远高于其自然栖息地温度的温度下生长得更快(32).因此，冷适应细菌可能比中温细菌更快地适应高温。
结果
使适应寒冷的细菌适应高温
南极γ-蛋白细菌嗜盐假甲藻TAC125菌株是研究得最好的冷适应细菌之一(33).它的基因组由两条染色体和两个质粒组成(34–36).它可以生长在?2.5°C和29°C，但在20°C以上已经出现热应力迹象(37,38).因为P、 浮游卤虫是一种来自南极沿海海域的天然分离物，在实验室条件下暴露有限(34)，我们首先在15°C的温度下对其进行145代适应，然后从相对于野生型生长最快的预适应克隆开始所有进一步的实验P、 浮游卤虫TAC125菌株。克隆生长增加的可能原因是它的整个2号染色体的复制，它编码一个葡萄糖酸转运体和一个葡萄糖酸激酶，两者都参与细胞的运输和代谢d-葡萄糖酸，我们生长培养基中唯一的碳源（表S1）。
从这个预适应的克隆开始，我们挑战P、 浮游卤虫为了适应逐渐升高的温度，温度最终超过了野生型菌株TAC125的上限，就像热浪一样。简单地说，我们在分批培养中通过连续转移，逐步将温度从20°增加到22°C、24°C、26°C、28°C、29°C和30°C。同时，我们在15°C（野生型最适生长温度）下进化出12个重复对照群体(图1A).在30°C时，即超过野生型和预适应克隆的温度限制（图S1），种群规模开始显著减少（与29°C下的生长相比平均减少26%，与28°C下的生长相比减少37%）。然而，所有种群的种群规模都恢复了。复苏显示出典型的进化拯救的U形曲线，即人口规模下降后，人口数量增加(图1B).这次救援非常迅速。根据人口的不同，它只需要70到270代（图S2）。总之，经过900代在逐渐升高的温度下进化，所有30个复制种群都能够在超过祖先温度极限的温度下生长(图1C图S3）。一般来说，适应30°C并不涉及在较低温度下生长的权衡（图S4和补充文本），但可能存在个体突变水平的权衡。
图1.适应逐渐升高的温度。
(A)实验设计。在900代的温度逐渐升高的情况下，我们从一个预先适应的克隆进化出30个复制群体。为了确定适应温度上升的遗传基础，我们对整个实验中分离的克隆的基因组进行了测序。(B)细菌密度，用600 nm（OD）下细菌培养物的光密度进行量化600)作为时间的函数，30个进化种群中的每一个。每一行对应于一个总体的数据。背景色（见图例）表示我们测量细菌密度的温度。(C)适应值随温度增加而增加。使用初始预适应克隆（蓝线）或适应每个温度的种群（红线）在不同温度下（见面板标签）测量23小时的生长曲线。预适应克隆的生长曲线是12个生物复制品的平均值，进化种群的生长曲线是90个生物复制品的平均值（30个进化种群中每个种群有3个复制种群样本）。阴影区域和虚线表示95%的置信区间。
在查看器中打开适应度在整个实验过程中都在增加，但相对增加最高的是在最高温度下(图1C)，这与之前的实验一致(27).然而，即使在30℃下经历了300代的进化，我们的种群也未能在更高的温度下生长。不到一半的种群在31℃下生长到非常低的光密度，并且没有种群在32℃下生长（图S5）。为了证实这些观察结果，我们恢复了终点种群，并在30℃的驯化期后，在31℃下进行了两次连续转移。在这些实验中，即使我们每48小时而不是每24小时进行一次连续转移，终点群体在31℃下也无法生长。虽然在31℃下孵育（和不繁殖）的种群在15℃孵育后恢复生长，但在32℃孵育的种群在15℃下没有恢复生长。这些结果表明，虽然生长的上限在30℃到31℃之间，但存活的上限在31℃到32℃之间。总之，在我们的实验中，我们发现了这种细菌进化拯救的一个极限。
与温度适应有关的遗传变化
为了确定与热适应相关的突变，我们对从适应不同温度的群体中分离出的192个单克隆进行了测序，这些克隆来自实验期间不同时间点（22°、26°、28°和30°C），以及在15°C下进化的对照群体。对于中间时间点和对照群体，我们为每个群体测序一个克隆，对于适应30°C的终点群体，我们为每个群体测序三个克隆。我们注意到我们实验设计的一个固有的局限性，即从高温中分离出来的克隆比从较低温度下分离出来的克隆进化的时间更长，并且在具有更高背景遗传变异的群体中进化。
我们在测序的基因组（数据文件S1）中发现了940个突变，所有这些突变肯定都是从头开始的，因为我们从一个已知基因组序列的克隆开始实验。在我们实验的时间尺度上，基因漂移是可以忽略的，因为我们的种群至少有10个8个人。因此，大多数观察到的突变都是有益的，或是通过有益的突变来达到高频率的。最常见的突变是点突变（62%），其次是指数突变（32%）（表S2和数据文件S2）。在我们鉴定的585个点突变中，498个（85.1%）是错义变异，只有20个（3.4%）是同义突变。一半的indels导致了框架内的插入和删除，只有10%的突变导致了框架移位和密码子的停止，这可能会破坏蛋白质的功能。只有12%的突变位于编码区之外（表S3）。
在30°C时，我们检测到的每个克隆的新变体数量比所有其他温度下都要高[Wilcoxon秩和检验，双尾错误发现率（FDR）–调整P所有成对比较中<0.005的值](图2A)可能是因为随着温度的升高，选择会加剧。这些变异优先出现在与蛋白质转换和伴侣功能有关的基因中，在细胞壁/膜的生物发生中，以及在能量生产和转换中（Fisher检验，单尾FDR校正）P价值≤0.05）（图S6、表S4和补充文本）。温度升高对细胞生理学的两个主要影响是蛋白质变性和流动性增加引起的膜完整性破坏(39).蛋白质转换和伴侣功能的突变，以及细胞壁和膜的生物发生可能有助于克服这两个问题。
图2.遗传变异的数量，以及平行进化的发生率，随着温度的升高而增加，变异在某些种类的基因中优先积累。
(A)在每个温度下识别的变体数量的比率，用自上一个温度以来经过的世代数（×100）标准化。这一代数相当于从20°C到22°C的232代，从22°C到26°C的139代，从26°到28°C的182代，以及从28°到30°C的350代。每个数据点代表一个克隆。(B)我们将突变的基因分为功能类别（数据文件S3），并在基因类别突变发生的每个温度下为每个测序克隆指明。上横轴显示温度，右纵轴显示功能基因类别。小的彩色竖线表示每个已排序的克隆。适应30℃的无性系按种群进行分组。在每个功能类别旁边，一个条形图显示了在给定温度下具有该类别突变的克隆的比例。只显示部分功能类别；图S9显示了完整列表。
在查看器中打开此外，在高温下，我们更倾向于观察到氨基酸的替代，这有助于提高蛋白质的稳定性。这些替代物降低了甘氨酸和丙氨酸的含量，增加了蛋白质的柔韧性，增加了亮氨酸和异亮氨酸（均为疏水性）的频率，有助于稳定蛋白质核心（表S5和S6及补充文本）(40).
高度平行突变集中在少数基因和基因组区域
如果一个新的遗传变异在平行进化的群体中多次出现，它就特别有可能是适应性的。为了确定主要负责进化拯救的变异，我们接下来更详细地研究了在30℃下发生的平行突变。这些突变的主要靶点是Lon蛋白酶：90%的克隆能适应30℃的突变龙基因。此外，87.5%的克隆含有减少2号染色体拷贝数的突变（通过两条遗传途径；图S7和S8，表S7和补充文本），85%的克隆携带一个或多个参与细胞壁生物合成的基因突变（除其他外mipA公司,拉布,巴马，和lpxC公司).综合起来，适应30℃的所有克隆在这三类变体中至少有一种发生了变化(图2B，图S9和补充文本）。
两种突变龙在亚致死温度（分别为28°C和26°C）下，2号染色体拷贝数减少的突变出现，并且随着温度的升高而增加(图2B，图S9、表S8和补充文本）。此外，在不同温度下测得的生长曲线显示，2号染色体的复制有利于26℃以下的生长（图S1），这很可能是因为它增加了d-葡萄糖酸（2号染色体含有葡萄糖酸转运体），它是我们最小介质中唯一的碳源。然而，在26℃以上的温度下，复制减少了生长（图S1）。
总之，我们的分析强烈表明，在30°C下，两种最常见的突变是龙第2号染色体拷贝数的减少，正推动着对高温的适应，对拯救种群免遭灭绝至关重要。此外，我们的观察结果验证了进化救援理论的预测，即亚致死状态下的变异有助于适应致命条件(11).
蛋白质错误折叠限制了高温耐受性的扩展
Lon蛋白酶是一种依赖ATP（腺苷5'-三磷酸）的蛋白酶，存在于细菌、古生菌和真核生物中(41).它降解错误折叠和突变蛋白质，包括许多调节蛋白(41).Lon蛋白酶识别疏水基序，疏水基序通常位于蛋白质的核心，只有当蛋白质折叠错误时才会暴露出来(41).
值得注意的是，在30°C下存活的克隆中有90%含有Lon蛋白酶突变，但更值得注意的是，72.5%的克隆（来自20个不同群体的58个克隆）具有完全相同的突变，即三个氨基酸的插入（表S9）。我们可以排除交叉污染作为这种极端平行性的可能来源，因为我们发现克隆中的插入是从非连续井甚至不同平板上的种群中分离出来的。此外，氨基酸插入是克隆间唯一共享的突变。因为我们的祖先没有突变，这些平行的突变一定是在我们进化的群体中独立发生的。最合理的解释是，插入位于一个重复区域（TGC-CGA-CAT-TGG-CGA-CAT），是由DNA复制滑移引起的，这导致了第三个重复单元（TGG-CGA-CAT）的增加。像这样的插入可能会降低蛋白质的表达，但是Western blot实验表明情况并非如此（图S10）。插入也不太可能通过稳定Lon蛋白酶有益，因为它定位于蛋白质表面。使用FoldX进行稳定性评估(42)软件显示突变是不稳定的（ΔΔG=5.523千卡/摩尔）。插入发生在N端域中(图3A以及补充文本），这对于Lon与错误折叠的蛋白质底物的结合至关重要(41).
图3.Lon蛋白酶的突变是适应高温的关键。
(A)三个氨基酸（Met-serpro）插入突变（橙色）的同源性模拟P、 浮游卤虫使用瑞士模式和PDB结构6v11的Lon蛋白酶（氨基酸253到775）(https://www.rcsb.org/structure/6V11)作为模板。该结构为同六聚体，其中六个单体中的四个与ADP（5'-二磷酸腺苷）结合。插入发生在N-末端结构域的三螺旋束区域，其颜色为绿松石色。(B)最大人口密度(K)在E、 大肠杆菌BL21菌株携带一个空质粒（gray），一个表达野生型Lon蛋白酶的质粒P、 浮游卤虫（蓝色），或表达突变（Met-serpro插入）Lon蛋白酶的质粒P、 浮游卤虫（红色）。我们对每个人进行了12次生物复制测量E、 大肠杆菌和质粒组合（圆圈）。mut，突变型；野生型。
在查看器中打开因为P、 浮游卤虫不是一个模式生物，在其基因组中设计特定基因的工具是有限的。为了证实Lon蛋白酶插入突变体具有对高温的适应能力，我们将野生型Lon蛋白酶和插入突变体同时表达在E、 大肠杆菌对Lon蛋白酶缺乏的菌株BL21。因为我们的实验结果预测Lon蛋白酶突变体应该能够促进生长，但是只有在高温下，我们测量了它在30℃、37℃和40℃下对生长的影响。在37℃下，突变没有优势，在30℃下，野生型和突变Lon蛋白酶的过度表达是不利的(K阴性=0.740，K隆特=0.658，K隆穆特=0.638，Wilcoxon秩和检验，单尾P在所有成对比较中，<0.01）。最关键的是，在40°C时E、 大肠杆菌当表达突变体Lon蛋白酶时，生长到显著更高的密度(K隆特=0.800，K隆穆特=0.850，单侧Wilcoxon秩和检验，P=0.006）(图3B，无花果。S11至S13和表S10）。
讨论
虽然进化拯救是避免暴露在环境压力下的种群灭绝的关键，但它是否能够拯救暴露在温度超过其最高耐受温度的种群，目前还不清楚。我们的实验遇到了进化救援的限制，这是我们实验条件下存在的。明确地，P、 浮游卤虫种群适应于在30°C下生长，温度超过温度上限1°C，但它们不能适应在更高温度下生存。
允许P、 浮游卤虫在30°C下生存也有助于我们了解是什么阻止了这一温度极限的进一步延长。最常见的突变发生在Lon蛋白酶中，一种存在于生命各个领域的蛋白质。Lon蛋白酶是蛋白质质量控制机制中的主要蛋白酶，这种机制通过表达伴侣和蛋白酶来避免错误折叠蛋白质的积累(41).第二个最丰富的突变减少了2号染色体的拷贝数。蛋白质错误折叠导致的适应度成本随着蛋白质含量的增加而增加(43)因此，2号染色体拷贝数的减少可以提供一个适应度益处，因为它可以帮助减少数百种蛋白质（占生物体基因的13.5%）的表达。值得注意的是，2号染色体复制增强了低温下的适应度，只有在最高温度下才降低了适应度。2号染色体的复制在自然群体中还没有报道，其逆转可能与他们无关，但这与我们实验中蛋白质错误折叠的关键作用是一致的。
温度极限和蛋白质错误折叠之间的联系通过增加蛋白质稳定性的突变进一步加强，例如在最高温度下增加亮氨酸和异亮氨酸残基，以及失去甘氨酸和丙氨酸残基。考虑到所有的证据，我们假设对高温的适应可以通过Lon蛋白酶的突变来减轻错误折叠蛋白质的负担，这可能会增加错误折叠蛋白质的降解，或者通过稳定突变来避免蛋白质变性。由于这种缓解策略在超过30℃时失效，我们得出结论，在我们的实验中检测到的进化拯救的限制是由蛋白质错误折叠造成的。然而，我们研究的一个局限性是，来自适应30℃的克隆体的基因组数据只能间接证明是什么限制了进化拯救。
是什么原因导致了进化救援的极限仍然未知。一种可能的情况是，那些能延长温度上限的突变是罕见的，或者被携带不延长上限的更适合适应性突变的克隆所超越。另一种可能性是没有一种单步适应性突变能够克服高温造成的生理界限。后者表明存在一个硬极限(9,10).即使是硬限制也可以用足够的时间来克服，但这一时间的长短取决于必要的基因变化次数。例如，温度诱导细胞死亡E、 大肠杆菌由83种蛋白质的变性所驱动，其中14种是必需的(44).基因突变率为10?三每代核苷酸突变(45)，14到83个基因的独立突变需要很长的等待时间，即使在大的群体中也是如此。相比之下，在我们900代人的实验中，P、 浮游卤虫平均每个基因组只有9个新的基因变异。然而，当环境变化足够缓慢时，即使是很长的等待时间也不是禁止的。
进化拯救在那些逐渐变得紧张的大种群中是最容易的(13–16).然而，即使数量庞大的种群也不能幸免灭绝(46).此外，尽管全球气候变化是一个渐进的过程，但它也会导致突发和极端的气候事件，如热浪、飓风和干旱(三,4,47).像这样的事件会对野生种群产生显著的影响，并且已经导致一些当地种群（如大黄蜂、珊瑚、飞狐和海带林）的灭绝(46–51).例如，影响澳大利亚南部大堡礁的海洋热浪使温度超过了海带的耐热性(≈2.5°C（高于最高海温2.5°C），导致海带森林消失，并被海藻草皮取代(49).
模型预测，如果全球变暖到21世纪末达到3.5℃，那么海洋热浪的长度、强度和频率将增加，平均持续时间为112天，比最高海平面温度高2.5℃(52).我们实验的目的是评估种群的进化潜力，以快速改变它们的热上限，例如在海洋热浪的背景下。这里的上限是指热再生极限，预计低于致命阈值临界热极限(53).我们的实验旨在通过使用一个逐渐变化的环境，一个小生物的大种群，以及一个生活在比其最高热耐受性低几度的温度下的有机体，使进化救援尽可能容易，而这一点先验上应该有助于适应。然而，即使在这些有利的条件下，我们也只能将温度上限延长1℃，如果全球变暖达到3.5℃，根据预测，这可能是不够的。我们的观察表明，我们研究的生物体的上限温度的进化性很低，这与最近热带鱼类的研究结果一致(10).蛋白质的错误折叠是导致进化拯救受到限制的主要原因。由于进化救援在人口较少的大型宏观生物中更为困难，因此对这些生物而言，救援的限制将更为频繁，尤其是当它们生活在接近其耐热性的温度下并且受到极端气候事件的影响时，这会导致极端温度超过它们的热容限。
材料和方法
菌种及生长条件
我们得到了P、 浮游卤虫来自巴斯德研究所生物资源中心的TAC125菌株（CIP108707）。我们在最小海洋海水培养基中培养了该菌株2人事军官4（1克/升），NH4不三（1克/升）、氯化钠（10克/升）、硫酸镁4·7小时2O（0.2克/升），氧化亚铁4·7小时2O（0.01克/升）和氯化钙2·2小时2O（0.01克/升）（pH=7）](37)补充d-葡萄糖酸（0.1%），15°C，225 rpm，在培养摇床（INFORS HT Ecotron）上摇动。我们用过E、 大肠杆菌DH5α和E、 大肠杆菌用于克隆和扩增目的的TOP10E、 大肠杆菌在37°C的LB培养基中培养，在卡那霉素（30μg/ml）存在下培养重组菌株。
预适应实验
P、 浮游卤虫TAC125是一种天然分离物，为了使其适应实验室条件和最小的海水介质，我们进行了一个短期的预适应实验。简单地说，我们从48孔板（P-5ML-48-C，Axygen）中的一个克隆，在2ml的最小海洋海水培养基中，进化出12个复制种群d-葡萄糖酸（0.1%）在孵育摇床（INFORS HT multitron）中以400 rpm的转速振荡（VWR微孔板振动筛）。我们每48小时将每个种群稀释100倍，持续15天，然后每天稀释15天，大约构成145代进化。
在预适应实验结束时，我们分离出几个单克隆，并评估它们对48小时内记录的最小培养基生长曲线的适应性。为了做到这一点，我们在48孔板中的最小培养基中培养预适应克隆的冷冻储备过夜，在15°C下，以400 rpm的转速振荡。然后，我们在96孔板（TPP 92096）中将过夜培养物稀释100倍至200μl最终体积的最小培养基中，并使用平板阅读器（Tecan Infinite Pro F200）在20°C条件下每10分钟测量600 nm处的吸光度。我们使用了一个内部制造的外部冷却器将读板器冷却到20°C。对于每个克隆，我们使用了Growthcurver R软件包(54)为了估计生长参数，我们将其相对适应度确定为预适应克隆与野生型克隆最大种群密度的差异。我们选择了相对适合度最高的克隆体进行进一步的实验。此后，我们将此克隆称为预适应克隆。
实验进化
我们进化出30个复制群体。我们从从预适应克隆中分离出的单个菌落中，在48孔板中，在2ml的最小海洋海水培养基中加入d-葡萄糖酸（0.1%）和在400 rpm和20°C下摇动。为了减少同一平板上的孔受到污染的可能性，我们以棋盘格式排列复制群体，交替使用含有细菌培养物的孔和仅含有生长介质的孔（marine Bouth 2216，BD-Difco）。此外，我们没有使用每个板块的外井，因为我们发现这些井的介质蒸发量更高。如下文所述，我们每天将30个复制群体转移到一个新的平板上进行繁殖，并逐渐提高温度，在20℃下开始实验，在900代进化后在30℃结束实验。为了监测对温度的适应，我们每7天用平板阅读器（Tecan Infinte Pro F200）测量23小时内的生长曲线，评估进化种群的相对适应度。具体地说，在给定温度下生长的第一天，我们将每个进化种群在200μl的最终体积中稀释100倍于96孔板（TPP 92096），每个进化种群分三次重复，并记录每个重复的生长曲线。每天转移1周后，我们重复这一过程，但这一次，我们标准化培养物的细胞密度，以开始生长曲线，其密度与在焦点温度下生长的第一天相同。我们用的是Growthcurver R软件包(54)用logistic方程拟合数据，估计各群体的生长参数。我们将相对适应度计算为进化种群和种群在给定温度下生长的第一天最大种群密度的差异。如果超过一半的进化种群提高了它们的相对适应度，我们将温度再提高2℃。如果少于一半的种群适应度提高，我们将当前温度维持一周，然后重复整个过程。我们不能用竞争性适合度分析来评估适合度，因为我们的祖先克隆体不会在高于29°C的温度下生长。
对于实验进化过程中培养物的日常转移，我们使用了一个稀释因子，使我们能够在至少一半的复制种群中保持稳定的种群规模。具体来说，为了避免种群以一种可能导致其最终灭绝的速率稀释，我们要求种群达到接近转移时间的稳定阶段，这是我们通过测量前面提到的每周增长曲线确定的。在实验过程中，我们将温度提高了6倍（22°、24°、26°、28°、29°和30°C）。由于种群连续增长较慢，在较高的温度下达到较低的种群密度，我们必须随着时间的推移调整稀释因子。具体地说，我们在20°C和28°C之间使用了1:100的稀释因子，在28°C和29°C下使用了1:50的稀释因子，在30°C下使用了1:25的稀释因子。在20°C下，在20°C下使用了46代，在24°C下使用了46代，在26°C下使用了93代，在28°C下使用了182，在29°C下使用了39，在30°C下使用了311代。
与我们的30个主要种群平行，我们在15°C的恒温、2mL的体积和每天100倍的稀释度下进化出12个对照种群。我们选择15°C的温度是因为它是P、 浮游卤虫(34).我们通过准备甘油储备每周对所有进化种群进行归档。具体来说，我们将1毫升细胞培养物加入500毫升无菌60%甘油中，并将所得悬浮液储存于?80摄氏度。
我们用了几种方法来控制污染。首先，如果我们观察到在一个只含有甘油的培养基中生长，我们就从甘油储备中重新开始实验。第二，控制可能的污染E、 大肠杆菌（实验室常规使用），我们每周对进化种群进行100倍稀释，放入含有LB培养基（Difco 244620）的48孔板中。我们在37°C的微量平板摇床（Stuart microtiter 51505）中以400转/分的速度将培养板培养24小时，并目测任何可观察到的生长情况。我们没有发现任何此类增长的例子，表明E、 大肠杆菌没有发生。第三，我们每个月用20μl的培养物对每个进化群体进行聚合酶链反应（PCR）。我们使用了四组引物：两对PSHA_RS07527和PSHA_RS01895特异性引物P、 浮游卤虫TAC125基因和两套EG11498和EG11973特异性引物E、 大肠杆菌基因（表S11）。此外，我们随机选择了5个群体，并对16个群体进行了测序S核糖体RNA基因证实进化中的种群P、 浮游卤虫.第四，我们仔细检查了基因组序列数据，以寻找交叉污染的证据，但没有发现任何此类证据。为此，我们计算了每个时间点（22°、26°、28°和30°C）的热图，并检查了克隆簇的热图。对于聚集在这张热图中的任何克隆体，我们确定了它们共有的突变。我们发现所有的聚类都是由基因突变引起的，这些基因以高度平行的方式进化（例如，Lon蛋白酶和瑞帕).
估计适应30°C的成本
为了研究适应30°C是否需要在20°C（我们开始进化实验的温度）下进行权衡，我们培育了在20°C时适应30°C的克隆。为此，我们从甘油储备开始过夜培养80个适应30°C的克隆。我们在2 ml最小海洋海水培养基中培养这些克隆，并补充d-葡萄糖酸（0.1%）并在20℃下培养。然后我们将过夜培养物稀释100倍于200μl最小培养基中，并在600 nm（OD）下测量光密度600)每10分钟使用一个读板器，持续23小时。我们对每个克隆进行了5次生物复制。为了进行这些测量，我们使用外部冷却器将读板器冷却到20°C。
全基因组测序
为了研究温度适应的遗传基础，我们从适应不同温度的群体（即在实验过程中的不同时间点）中分离克隆。具体来说，我们从22°、26°、28°和30°C下生长的最后一天选择克隆；这是四种温度，在这四种温度下，种群的世代数最多。我们使用微量海洋海水琼脂，添加0.1%d-用葡萄糖酸从冷藏库中分离出单个克隆，并为每个分离的克隆制备新的冷冻原料。为了确认克隆对特定温度的适应能力，我们测量了每个分离克隆的生长曲线。特别地，我们从克隆的甘油储备中制备过夜培养物，在2 ml的最小海洋海水培养基中添加d-葡萄糖酸和培养基在相应温度下振荡培养。然后，我们按照与实验进化相同的方法，将过夜培养物稀释到最终体积为200μl的培养基中，并在平板阅读器中测量其23小时的生长曲线。
我们从隔夜培养的分离克隆（2×10）中提取基因组DNA（gDNA）9细胞）在添加0.1%的最小海洋海水培养基中生长d-葡萄糖酸。为此，我们使用了DNeasy血液和组织试剂盒（QIAGEN）。简单地说，添加蛋白酶K后，我们在56°C下培养裂解物1小时。然后，我们向裂解物中添加缓冲液AL，并在添加乙醇之前在70°C下孵育10分钟。我们在100μl的EB缓冲液（QIAGEN）中洗脱DNA。为了评估提取的gDNA的数量和质量，我们使用了Qubit荧光计dsDNA广域分析（Life Technologies）和纳米滴（NanoDrop ND-1000，Thermo-Fisher Scientific）分光光度计，在0.7%琼脂糖凝胶上检查DNA的完整性。我们用同样的程序提取E、 大肠杆菌MG1655用于克隆目的。
在牛津基因组中心进行了文库准备和测序[HiSeq 4000，150-碱基对（bp）配对末端阅读]。对于适应22℃、26℃和28℃的种群，我们为每个种群测序一个克隆，对于适应30℃的种群，我们为每个种群测序3个克隆，除了种群13（在琼脂平板上没有克隆生长）和25（由于技术错误，我们只获得了两个克隆）。我们总共测序了192个克隆：1P、 浮游卤虫TAC125野生型克隆，1P、 浮游卤虫TAC125预适应克隆，12个对照克隆，30个适应22°C的克隆，30个适应26°C的克隆，30个适应28°C的克隆，86个适应30°C的克隆。为了分析测序数据，我们更新了我们之前开发的管道(55).简单地说，在这个管道中，我们使用FastQC（v.0.11.9）（RRID:SCR_014583）进行初始序列质量控制。然后，我们使用Trim-Galore（v0.4.5）（RRID:SCR_011847）和BWA-MEM（0.7.17）来修剪读数(56)将筛选的读取映射到P、 浮游卤虫TAC125基因组（NC_.1，NC U 007482.1(34))包括两个已描述的质粒pMtBL（AJ224742.1）(35))和pMEGA（MN400773.1(36)).然后，我们使用Picard（v.2.17.11）（RRID:SCR_006525）删除重复读取和GATK（v3.8）(57)为了重新排列。我们使用了Samtools（v1.7）(58)和GATK（v3.8）(57)用于变量调用和Pindel（v0.2.5b8）(59)和霹雳舞者（v1.1）(60)用于结构变量调用。我们用SnpEff（v4.3T）对识别出的变体进行注释并预测其功能效应(61).最后，我们使用了QualiMap（v2.2.1）(62)评估测序数据的质量。我们样本的平均覆盖率是每个基因组站点114次读取。同时，我们也使用了管道布雷塞（0.32.1a版）(63)为了确定在我们的实验中发生的突变，获得了与使用我们的内部管道基本相同的结果。我们在适应30°C的群体中鉴定出6个超突变克隆。它们包括从群体1（突变多基因）和从群体11分离的三个克隆（突变mutS公司基因）。我们从所有进一步的分析中丢弃了这些克隆体。如果突变位于基因起始点上游150 bp以上，我们将其归类为基因间突变。
在一些分析中，我们只考虑相互独立的突变。在这些分析中，我们只对每个突变进行一次计数，即在我们鉴定出它的第一个温度时。对于适应30℃的克隆，如果从同一群体中分离出的三个克隆中有一个以上发生突变，我们只计算一次。
功能富集分析
为了研究在我们的实验中观察到的突变的功能含义，我们使用了同源组的COG[簇](64)]分配给的类别P、 浮游卤虫TAC125基因，我们从显微镜上下载的(https://mage.genoscope.cns.fr/microscope/home/index.php).具体地说，对于每个温度和COG类别，我们将在给定温度下分配给给定COG类别的突变比例与对应的突变比例（但所有其他温度加在一起）进行比较。为此，我们构建了一个2×2列联表，使用（i）在选定温度下分配给查询COG类别的突变数，（ii）在选定温度下分配给其他COG类别的突变数，（iii）在所有其他温度下分配给查询COG类别的突变数，以及（iv）在所有其他温度下分配给其他COG类别的突变数量。我们用这个表进行了单尾Fisher检验(65)评估统计学意义。我们的无效假设是，给定COG类别的突变比例没有温度依赖性差异。我们用Benjamini-Hochberg方法修正了多重测试(66).
Lon蛋白酶的结构分析
因为三级结构P、 浮游卤虫Lon蛋白酶不存在，我们用同源性建模的方法得到了一个三级结构P、 浮游卤虫野生型Lon蛋白酶，以及我们鉴定的带有三个氨基酸插入的Lon蛋白酶。我们用两个软件包SWISS-MODEL模拟了三级蛋白质结构(67)还有I-TASSER(68).在瑞士模型中，我们使用了来自鼠疫耶尔森菌（79.12%的序列与P、 浮游卤虫)作为同源建模的模板。我们用了杰莫(69)三级结构的可视化。为了评估三个氨基酸的插入对蛋白质稳定性是否有影响，我们使用了FoldX算法(42)用I-TASSER得到了三级结构(68).为此，我们首先在FoldX中使用RepairPDB命令修复三级结构(42).然后使用Optimize命令优化修复后的三级结构。最后，我们使用stability命令计算稳定性。我们比较了Lon野生型和Lon突变体的稳定性，并计算了ΔΔG从这个比较中。
Western印迹检测Lon蛋白酶表达
为了评估Lon蛋白酶野生型和不同突变版本的蛋白表达水平，我们进行了Western印迹实验。我们通过离心（5分钟，室温下5000转/分）收集1毫升细菌培养物，并将颗粒重新悬浮在4×Laemmli样品缓冲液（LDS）中，最终比例为每天100μl600文化。我们在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶（TruPAGE 4至12%Prect gels，Sigma-Aldrich）上分离这些细胞提取物的蛋白质部分，并根据制造商的方案，使用Bio-Rad微型蛋白试剂盒将蛋白质转移到聚偏氟乙烯膜上。在用3%脱脂牛奶在磷酸盐缓冲盐水（PBS）和0.1%吐温20中孵育1小时后，我们用PBS和0.1%吐温20清洗膜一次，并用抗Lon蛋白酶抗体（Biorbyt，1:5000稀释）在4°C下孵育过夜。我们用PBS和0.1%吐温20洗涤膜三次，每次10分钟，并在室温下用1:2500稀释的辣根过氧化物酶结合抗兔抗体（GE Healthcare）培养2小时。最后，我们用PBS和0.1%吐温20清洗三次印迹，并根据制造商在LAS4000成像仪（Fujifilm）上的协议，使用ECL系统（GE Healthcare）对其进行冲洗。
Lon蛋白酶在大肠杆菌中的表达E、 大肠杆菌
为了证实Lon蛋白酶突变对高温适应的关键作用，我们表达了野生型Lon蛋白酶和具有最常见突变（三个氨基酸插入）的Lon蛋白酶E、 大肠杆菌.为此，我们使用质粒pUCNOmpA-EYFP-1（图S14），它包含构成性启动子奥帕对于蛋白质表达，有一个pUC来源，一个卡那霉素抗性基因和一个EYFP（增强黄色荧光蛋白）编码基因（表S12）。简单地说，为了构建这个质粒，我们替换了质粒pmss201_ompA的pSC101来源(70)pUC来源于pBAD202/D-TOPO（Invitrogen，K420201）。我们用全质粒聚合酶链反应（PCR）去除EYFP编码基因，获得空对照质粒（引物见表S11）。接下来，我们放大了Lon-Ph重量（野生型Lon蛋白酶）和Lon Ph14.1（带有三个氨基酸插入的Lon蛋白酶）来自P、 浮游卤虫TAC125野生型（CIP108707）和P、 浮游卤虫TAC125 30°C-14.1克隆（克隆1从适应30°C的群体14中分离）。然后我们用吉布森PCR(71)用NEBuilderHiFi DNA组装主混合（New England Biolabs）将这些基因插入到pUCNOmpA中，得到两个质粒pUCNOmpA LonPh重量还有pUCNOmpA LonPh14.1（表S12）。
我们转化了我们设计的三种质粒（pUCNOmpA LonPh重量携带野生型Lon蛋白酶pUCNOmpA LonPh14.1携带突变的Lon蛋白酶和空质粒pUCNOmpA）进入E、 大肠杆菌BL21（DE3）电竞争电池（Sigma-Aldrich）。这个E、 大肠杆菌菌株缺乏内源性Lon蛋白酶E、 大肠杆菌.我们将转化菌的单个菌落接种到添加卡那霉素（30μg/ml）的LB培养基中，在37℃下培养过夜，并在220 rpm下振荡。我们把培养物稀释成OD6000.005，在96孔板（TPP 92096）中，每个培养基有12个重复，并通过测量OD监测细菌生长600在平板阅读器（Tecan Infinite F200 Pro）上放置48小时。我们测量了30°、37°和40°C下的生长曲线，以研究不同Lon蛋白酶的表达对生长的影响E、 大肠杆菌在不同的温度下。我们用的是Growthcurver R软件包(54)估计每个增长曲线的最大人口密度。
统计分析
我们进行了所有的统计分析，并用R(72).
