CRISPR-Cas9基因编辑系统的一种新变体使得为治疗应用重新设计大量细胞变得更加容易。由Gladstone研究所和加州大学旧金山分校(UCSF)共同开发的这种方法，让科学家们能够以非常高的效率将特别长的DNA序列引入细胞基因组的精确位置，而不需要传统上用于将DNA导入细胞的病毒传递系统。

“我们多年来的目标之一就是以一种不依赖病毒载体的方式将冗长的DNA指令放入基因组的目标位置，”Alex Marson博士说，他是Gladstone-UCSF基因组免疫学研究所的主任，也是这项新研究的资深作者。“这是迈向下一代安全有效的细胞疗法的一大步。”

在发表在《Nature Biotechnology》杂志上的一篇新论文中，Marson和他的同事不仅描述了这项技术，而且展示了它如何被用来产生CAR-T细胞，这些细胞有潜力对抗多发性骨髓瘤(一种血癌)，以及改写基因序列，突变可能导致罕见的遗传性免疫疾病。

“我们证明，我们可以在一次运行中设计超过10亿个细胞，这远远超过我们治疗单个病人所需的细胞数量，”第一作者Brian Shy说。

从双链到单链DNA  

CRISPR-Cas9是一种在活细胞内编辑基因的系统，在过去十年中一直被用作基础研究工具。越来越多的临床科学家对CRISPR-Cas9产生活细胞疗法的潜力感到兴奋。通过基因编辑，人们可以关闭、删除或替换突变的致病基因，或增强免疫细胞的抗癌活性，等等。虽然CRISPR-Cas9的首次治疗应用最近已进入临床试验，但该技术仍然受到安全制造大量正确编辑的细胞的挑战的限制。

传统上，研究人员依靠病毒载体——不含致病成分的病毒外壳——携带用于基因治疗的DNA(称为DNA模板)进入细胞。然而，大量生产临床级病毒载体一直是患者获得细胞疗法的主要瓶颈。此外，研究人员无法轻易控制传统病毒载体在基因组中插入基因的位置。

“使用病毒载体是昂贵和资源密集型的，”Shy说。“非病毒基因工程方法的一个主要好处是，我们不受成本、制造复杂性和供应链挑战的限制。”

2015年，Marson的团队与CRISPR先驱Jennifer Doudna博士的实验室合作，首次表明他们可以在没有病毒载体的情况下将短DNA模板插入免疫细胞，使用电场使细胞的外膜更具渗透性。到2018年，他们开发了一种方法，利用CRISPR将更长的DNA序列剪切并粘贴到免疫细胞中。然后，在2019年，研究人员发现，通过使用一种可以与Cas9酶结合的改良版DNA模板——在CRISPR基因编辑过程中充当分子剪刀的蛋白质——他们可以更有效地将新序列传递到目标基因组位点。然而，还需要更多的工作来提高成功改造的免疫细胞的产量，并使这一过程与未来细胞疗法的制造兼容。这些目标推动了该团队目前的研究。

DNA可以以单链或双链的形式存在(就像维可牢尼龙搭扣一样)，而Cas9吸附在双链DNA上。研究人员很快发现，高水平的双链DNA模板会对细胞产生毒性，因此该方法只能用于少量的模板DNA，导致效率低下。

研究小组知道，单链DNA对细胞的毒性较小，即使在相对较高的浓度下。因此，在这篇新论文中，他们描述了一种将改性Cas9酶附着在单链模板DNA上的方法，方法是在末端添加一个小的双链DNA悬吊物。

“这给了我们一个平衡的、两全其美的方法，”Marson说。

与较早的双链方法相比，单链模板DNA可以使基因编辑的效率提高一倍以上。分子的双链末端让研究人员可以使用Cas9来增强非病毒载体进入细胞的能力。

“这项技术有可能使新的细胞和基因疗法更快、更好、更便宜，”这项新研究的作者之一、UCSF实验室医学助理教授、Gladstone附属研究员Jonathan Esensten医学博士说。

通往医学转化

在这项研究中，研究人员使用新的DNA模板生成了超过10亿个靶向多发性骨髓瘤的CAR-T细胞。CAR-T细胞是一种经过基因改造的免疫T细胞，可以有效地对抗特定的细胞或癌症。使用新的单链Cas9定向模板，大约一半的T细胞获得了新的基因，结果，转化为CAR-T细胞。

“我们知道，将DNA模板定位到基因组中的一个特定位置，称为TRAC位点，将提高CAR-T细胞的抗肿瘤能力，”Justin Eyquem博士说，他是这篇新论文的合著者，UCSF血液和肿瘤学部门的医学助理教授，同时也是Gladstone的附属研究员。“这种新的非病毒方法使我们能够更有效地实现靶向，这将加速下一代CAR-T细胞疗法的发展。”

此外，研究人员首次表明，他们的方法可以完全替代与罕见遗传免疫疾病相关的两个基因IL2RA和CTLA4 基因．  

在过去，科学家已经证明，他们可以在特定患者发生突变的情况下替换IL2RA基因的小部分。现在，Marson的团队证明了他们可以一次替换整个IL2RA和CTLA4基因，这是一种“一刀切”的方法，可以治疗这些基因不同突变的许多患者，而不必为每个患者的突变生成个性化模板。用这种基因工程方法处理的细胞中，近90%获得了健康版本的基因。

研究人员目前正在寻求批准，以推进在CAR-T细胞疗法和IL2RA缺乏症治疗中使用非病毒CRISPR技术的临床试验。

High-yield genome engineering in primary cells using a hybrid ssDNA repair template and small-molecule cocktails