微生物虽然微小，但不可否认的是它们无处不在，与人类有着十分密切的关系。一方面我们与很多微生物和谐相处，比如肠道益生菌。而另一方面大量的病原微生物也给人类的健康甚至生命带来了巨大的威胁。因此，我们对微生物的研究始终都未曾停止过。

主要的研究方法包括经典的培养鉴定法、血清学检测、微生物核酸检测（如RT-PCR法）以及NGS分析等多种方法。其中相较于传统方式，NGS技术可以对疑难微生物以及难以培养的菌属进行核酸序列的测定（特别是在新型病原微生物流行监测方面），并且在检测时间、通量上具有无可比拟的优势，因此逐渐成为微生物研究领域的重要方法。
 
mNGS，也称宏基因组测序技术，是研究环境或人体等样本中所有以DNA为基因组的微生物遗传物质的技术，它的发展开启了微生物研究的新时代。这种技术不依赖微生物分离培养，可直接对临床样本中的核酸进行检测，分析微生物群落、以及微生物与宿主之间的相互关系。

ThruPLEX DNA-Seq Kit，实现对微量样品的可靠宏基因组分析

在某些情况下，以非常少量的临床样本作为研究对象进行宏基因组分析是难免的，这类样本包括临床拭子、体液、少量组织等。ThruPLEX DNA-Seq Kit支持50 pg-50 ng DNA起始，单管操作、手动15 min、总共两小时，过程中无需转管与纯化，轻松应对宏基因组建库难题！

■ 文献案例

皮肤是人体最大的器官，“网罗”了各种各样的微生物。多年来，虽然科研人员对涉及皮肤内稳态的微生物群落研究有了一些进展，但对皮炎与微生态失衡之间是否关联知之甚少。瑞典卡罗林斯卡医学院的Dr. Nanna Fyhrquist团队在Nature Communications杂志上发表了题为Microbe-host interplay in atopic dermatitis and psoriasis的文章，采用宏基因组学结合16s rRNA测序、宿主转录组测序分析技术，探讨过敏性皮炎、银屑病及健康人皮肤表面微生物群落特征，并与宿主皮肤转录组数据进行关联分析。

结果显示，过敏性皮炎与银屑病皮肤样品具有各自特有的微生物群落特征，并都与健康人样本的数据存在差异。其中，过敏性皮炎样本的优势菌为Staphylococcus aureus，与皮肤屏障功能、色氨酸代谢及免疫激活等宿主转录组数据有相关性；银屑病样本显示出共生的微生物群落结构，并与宿主疾病相关基因的表达存在弱相关性。

尽管mNGS 用于病原微生物检测具有诸多优势，但其技术上往往还面临着一些挑战：比如，样本中宿主（例如人源）核酸的干扰。由于宿主基因组大小很可能远大于微生物的基因组，目标基因片段在整体样本中的含量较低，不仅会导致检测成本偏高，甚至会出现目标基因片段太小而无法正确鉴定的假阴性结果。

针对上述这种情况，可以选择采用多重PCR（multiplex PCR）测序。在提高灵敏度的前提下，可以大大减少测序数据量，实现性能及成本的双优化。

Tip: 多重PCR也称复合PCR，它是在常规PCR基础上改进并发展起来的一种新型PCR扩增技术。它的基本原理与常规PCR相同，区别在于多重PCR是在反应体系中加入了两对以上引物，各对引物分别结合在模板相对应部位，最终扩增出两条以上目的DNA片段。
 
>> 多重PCR测序的操作流程

>> 多重PCR的优势

● 不受宿主基因组及背景菌影响：只对目标微生物进行检测，PCR产物不包含宿主基因片段及背景菌群基因片段。
● 实验时间和成本双双降低：mNGS会对样本中所有的核酸进行检测，而多重PCR测序只需针对特异性扩增片段检测，大大降低了检测时间和成本。
 
但多重PCR要想实现较好的扩增性能，需要考虑反应多方条件，具有较高的技术壁垒，而其中多重PCR酶的选择也是重中之重，所以这里“墙裂”推荐↓

Multiplex PCR Assay Kit Ver.2

它是由能快速进行Priming的酶与能很好提高引物退火特异性的反应液配套组成的Multiplex PCR用试剂盒。同以往Multiplex PCR Enzyme相比，可在短时间内特异性地进行无偏差的PCR扩增。另外，调整酶量和反应时间也可对大约200对引物进行Multiplex PCR。
 
■ 更加高效完成多重PCR反应的实验例

■ 多重PCR测序的实验例

使用Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 和本产品、以人基因组DNA为模板对207个目的基因进行Multiplex PCR，制备文库后进行NGS测序。

* The percentage of bases in all targeted regions (or whole genome) covered by at least 0.2× the average base read depth.

结果显示，通过对约500万reads进行测序，得到207个目的基因全部为500个reads以上，确认全部的目的基因可以被正确扩增！

我们相信，选择合适的方法和试剂，会让您的mNGS实验事半功倍。

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