单细胞分析技术的快速发展使得对样本分析不再受限于“细胞群体平均值”而能够逐个细胞分析其表达/转录组的异质性。由于细胞分泌物在免疫反应、代谢和细胞之间的交流中起着至关重要的作用，了解细胞分泌物是开发疾病治疗的关键——已知在表型相同的细胞群和不同的健康和病理细胞群之间都观察到分泌异质性——而细胞释放可溶性因子的时间和空间特征（例如时间上的持续时间和频率，以及细胞外空间的方向和分布）都会影响相关反应/信号通路的激活效率和特异性。深入研究蛋白质分泌物(统称为“分泌组”)在细胞间的空间和时间分布以及功能方面的固有异质性、了解细胞分泌的内部工作原理对于研究细胞生物学过程、探索动态疾病(如癌症)的演变以及开发新的药理疗法具有决定性意义，细胞分泌物的分析也应该实现逐个细胞分析。但目前在单细胞水平上分析细胞分泌物的方法只能提供半定量的终点读数——只报告分泌物的量，而不能详细说明它们是在何时何地产生的。

然而，对细胞分泌组的全面研究离不开单细胞水平的定量和实时分析。这种方法应具有较高的空间分辨率，以区分单个细胞和空间可视化分泌蛋白的分布，还应具有较高的时间分辨率，以识别分泌的快速或微小变化。现有方法如细胞内细胞因子染色(ICS)不能区分产生的蛋白质和实际分泌到外部介质的蛋白质，并损害细胞活力，无法使用细胞进行下游分析；酶联免疫斑点(ELISpot)可以在细胞外空间捕获活细胞分泌因子，但其空间分辨率不足以解析分泌方向和分布；由于缺乏足够的时间分辨率，这些方法通常得到的是端点结果而难以获得动力学信息。

无标记光学检测方法对生物传感和单细胞研究很有意义。特别是，表面等离子体共振(SPR)原理已被广泛采用和商业化，用于生物传感和生物成像配置中生物分子相互作用的实时量化。

现在，日内瓦大学的生物纳米光子系统实验室(BIOS)的研究人员开发了一种新的光学成像方法——无标记的纳米等离子体成像系统，能够对微孔阵列中的单细胞的分泌状况进行时空映射——即在空间和时间上提供细胞分泌过程的四维视图。该生物传感器包括金纳米孔阵列，支持用于检测的高灵敏度非常规光学传输(EOT)光谱，以及容纳大量单个细胞的二维微孔阵列。将单细胞分配到金纳米孔阵列中，然后在芯片表面诱导一种称为等离子共振的现象，在细胞分泌过程中用sCMOS相机直接测量大视场(FOV)上的EOT光谱随时间变化而产生的强度变化，而不需要光谱分析。这种无标签读出方法能够生成时间分辨和大面积的信号强度图像，经过图像处理技术和机器学习算法来增强，以在四个维度(x, y，强度，时间)构建“时空分泌图”，同时跟踪每个细胞的运动和形态。计算通道允许对数百个单个细胞的细胞外空间分泌产物进行精确的可视化、量化和长时间分析。科学家们认为，他们最近发表在《Nature Biomedical Engineering》上的这个新方法能够提供关于细胞如何功能和通信的前所未有的详细视图，在药物开发和基础研究方面具有巨大潜力。

BIOS负责人Hatice Altug强调：“我们工作的一个关键方面是，它允许我们以高通量的方式逐个筛选细胞。对许多细胞平均反应的集体测量并不能反映它们的异质性……在生物学中，从免疫反应到癌细胞，一切都是异质性的。这就是为什么癌症如此难以治疗。”

技术特点

方法的核心是一个1平方厘米的纳米等离子体芯片，它由数百万个小孔，和数百个安置单细胞的微孔组成。该芯片由纳米结构的黄金基材制成，上面覆盖着一层薄薄的聚合物网。每个培养孔都充满细胞培养基，以保持细胞在成像过程中存活和健康。 纳米等离子体成像是通过光束的作用而实现的，能够使金电子振荡。这种纳米结构经过精心设计，只有特定的波长才能穿透它。当蛋白质分泌等物质在芯片表面发生变化，改变了通过的光线时，光谱就会发生变化。CMOS图像传感器和LED将这种变化转化为CMOS像素的信号强度变化。

BIOS博士生和第一作者Saeid Ansaryan表示：“细胞分泌物就像细胞的语言：它们在时间和空间上动态扩散，与其他细胞连接。我们的技术在这些‘词语’传播的位置和距离方面捕捉到了关键的异质性。”“我们仪器的美妙之处在于，分布在整个表面的纳米孔将每个点转化为传感元件。这使我们能够观察到释放蛋白质的空间模式，而不受细胞位置的影响。”

验证系统

这种方法使科学家们得以窥见细胞分裂和细胞死亡这两个基本的细胞过程——他们绘制有丝分裂细胞分泌的时空变化，研究了蛋白质运输在细胞分裂过程中是如何受到影响的；又分析了不同细胞死亡途径下癌细胞总内含物释放的时空分布，获得了不同的特征，为研究其潜在机制提供了思路。

他们还研究了分泌抗体的B细胞——他们在单细胞水平上跟踪基因相同的工程杂交瘤细胞的免疫球蛋白G (IgG)分泌，捕捉细胞表面周围分泌产物的空间分布，并观察到各种分泌模式。

他们通过研究外周血单核细胞(pmcs)的分泌，证明了该系统对原代人类样本分析的广泛适用性——观察时间非常长，超过12小时，时间分辨率为分钟。

通过时空图提取释放因子的时间和空间特征有助于细胞信号机制的研究。研究结果表明，该系统与粘附细胞和悬浮细胞兼容，可用于检测不同类型的分泌分子，包括(但不限于)外泌体、细胞因子和抗体。因此，这代表了一个强大的和多功能的分析工具，可用于探索以前未被研究过的细胞间分泌变化的同质和异质种群。

技术优势

由于该方法将细胞浸泡在营养细胞介质中，并且不需要其他成像技术使用的有毒荧光标签，因此可以很容易让被研究的细胞恢复以进行下游分析。这使得该方法在开发药物、疫苗和其他治疗方法方面具有巨大的潜力——例如，帮助研究人员了解细胞在个体水平上对不同疗法的反应。“由于细胞产生的分泌物的数量和模式是决定其整体有效性的代表，我们也可以想象免疫治疗的应用，即筛选患者的免疫细胞，以确定哪些是最有效的，然后创建一个这些细胞的群体。”“我们看到在细胞死亡的两种形式——凋亡和坏死过程中细胞内容物的释放过程。在坏死过程中，细胞内容物以不对称的爆发形式释放，从而产生特定的图像特征/指纹。这在单细胞水平上从未被证明过，”Altug说。这种创新技术将令“细胞分泌组”的研究向前推进。