近日，北京大学生命科学学院、北大-清华生命科学联合中心、昌平实验室郭强研究员课题组在Journal of Structural Biology发表了题为“A practical multicellular sample preparation pipeline broadens the application of in situ cryo-electron tomography”的研究论文。在本项工作中，研究者提出了一种适用于多细胞样品冷冻电镜原位结构研究的实用流程，该流程包括样品分离（图1a）、冷冻样品制备（图1b），以及原位lift-out减薄（图1c）。

图1. 多细胞冷冻电子断层扫描样品制备流程示意图

该方法通过改进冷冻样品制备方法，使得样品能够完整且迅速地从冷冻填充剂中暴露出来（图1e），避免了传统冷冻保护剂所引入的样品定位难题（图1d），从而大大缩短了样品准备时间；通过优化lift-out样品减薄流程，在极大缩短样品减薄时间的同时大幅度提升成功率；通过设计新型电镜载网为薄片提供更好的机械支撑，最终可以获得稳定的较大薄区（图1f, 1g）。此研究为组织等多细胞样品的冷冻电镜原位结构研究提供了一种流程更简单、耗时更短、成功率更高的新方案。

采用此方法，研究者对小鼠胰岛进行冷冻电镜原位结构观察，首次实现了β细胞胰岛素晶体的原位分析（图2）。研究者观察到三种不同类型的囊泡，分别为棒状晶体囊泡（图2h），未成熟胰岛素晶体囊泡（图2i）以及成熟的胰岛素晶体囊泡（图2j），并对囊泡的数量与位置分布进行了统计（图2a，2k）。分析结果表明，成熟的胰岛素晶体囊泡占97%，且不同类型的胰岛素囊泡分布无明显特征。而此前使用单细胞体系研究发现，不同成熟状态的胰岛素囊泡呈现有组织的空间分布，说明了组织等多细胞原位结构研究的必要性。

图2. 胰岛β细胞的原位结构

通过对此流程所收集的数据进行了分析（图3），研究者原位确定了胰岛素的晶胞参数（图3c—f）。其与体外观察到的六方晶体的结构差异则表明细胞内生理条件对晶体堆积的潜在影响。

图3. 胰岛素晶体原位晶胞参数测定

郭强为本文的通讯作者。郭强课题组博士生吴伊春、北京大学生命科学学院秦昌东博士、郭强课题组技术员杜文静为本文的共同第一作者，北京大学陈良怡教授和郭振玺博士为该工作作出了重要贡献。本工作中的样品制备与数据收集在北京大学冷冻电镜平台完成，数据处理获得了北京大学未名超算平台的硬件和技术支持。该研究得到了科技部重点研发计划、北大-清华生命科学联合中心、生命科学学院、SLS-启东创新基金、蛋白质与植物基因研究国家重点实验室以及昌平实验室的经费支持。