改变血红蛋白基因的基因治疗可能是治疗镰状细胞病(SCD)和地中海贫血的答案。这两种常见的危及生命的贫血症折磨着全球数百万人。圣裘德儿童研究医院、麻省理工学院布罗德研究所和哈佛大学的科学家们使用了下一代基因组编辑技术——腺苷碱基编辑，重新启动了SCD患者细胞中的胎儿血红蛋白表达。与其他在人造血干细胞中使用CRISPR/Cas9核酸酶的基因组编辑技术相比，该方法将胎儿血红蛋白的表达提高到更高、更稳定、更均匀的水平。研究结果发表在今天的《自然遗传学》杂志上。

SCD和地中海贫血是影响数百万人的血液疾病;编码携带氧气分子血红蛋白的成人版本的基因突变导致这些疾病。恢复在发育中的胎儿中活跃的替代血红蛋白亚基的基因表达先前已显示出对SCD和地中海贫血患者的治疗益处。研究人员希望找到并优化编辑胎儿血红蛋白基因的基因组技术。通过腺苷碱基编辑安装的一种改变对于恢复出生后红细胞中的胎儿血红蛋白表达特别有效。

“我们发现碱基编辑器有意义地提高了胎儿血红蛋白水平，”首席通讯作者、圣犹达治疗基因组工程小组主任 Jonathan Yen博士说。“现在，我的治疗基因组工程团队已经在努力工作，开始优化碱基编辑，将这项技术应用于临床。”

血红蛋白掌握着关键

成人血红蛋白主要在出生后表达，包含四个蛋白质亚基——两个-珠蛋白和两个-珠蛋白。-珠蛋白基因突变导致镰状细胞病和-地中海贫血。但人类有另一种血红蛋白亚基基因(γ -珠蛋白)，它在胎儿发育期间表达，而不是β -珠蛋白。-珠蛋白与-珠蛋白结合形成胎儿血红蛋白。正常情况下，在出生前后，γ -珠蛋白的表达被关闭，而β -珠蛋白被打开，从胎儿血红蛋白转换为成人血红蛋白。基因组编辑技术可以引入突变，重新启动γ -珠蛋白基因，从而增加胎儿血红蛋白的产生，这可以有效地替代有缺陷的成人血红蛋白的产生。

Yen说:“我们使用基于编辑器创建了一个新的TAL1转录因子结合位点，该位点特别强烈地诱导胎儿血红蛋白。”“创造一个新的转录因子结合位点需要精确的碱基对改变——这是使用CRISPR-Cas9无法做到的，否则会产生不必要的副产物和双链断裂的其他潜在后果。”

“γ -珠蛋白[胎儿血红蛋白]基因是碱基编辑的一个很好的目标，因为有非常精确的突变可以重新激活其表达，以诱导出生后的表达，这可能为导致SCD和-地中海贫血的所有突变提供强大的‘一刀切’治疗，”St. Jude血清学系主任、共同通讯作者Mitchell Weiss医学博士说。

因此，科学家们希望恢复胎儿血红蛋白表达，因为这是一种比纠正SCD突变或数百种导致地中海贫血的突变更普遍的治疗主要血红蛋白疾病的方法。增加胎儿血红蛋白表达对大多数SCD或地中海贫血患者有潜在的治疗益处，无论其致病突变如何。研究人员之前已经展示了多种基因组编辑方法的原理证明，但这项研究是第一次系统地比较这些不同策略的功效。

“我们仔细研究了用于对胎儿血红蛋白基因进行治疗性编辑的核酸酶和碱基编辑器的个体DNA序列结果。由于核酸酶经常产生许多不同DNA序列结果的复杂、不受控制的混合物，我们描述了每个核酸酶编辑的序列如何影响胎儿血红蛋白表达。然后我们对碱基编辑结果做了同样的处理，结果更加均匀，”共同通讯作者David Liu博士说。

该研究发现，在γ -珠蛋白启动子中最有效的位点进行碱基编辑，HbF水平比Cas9编辑高2- 4倍。他们进一步证明，通过将健康供体和SCD患者的血液干细胞植入免疫功能低下的小鼠体内，这些碱基编辑可以在移植血液干细胞中保留下来。

解决安全问题

“最终，我们证明了并非所有的基因方法都是一样的，”Yen说。“碱基编辑器可能比其他技术更有效、更精确地进行编辑。但我们必须做更多的安全测试和优化。”

当比较安全性时，碱基编辑引起的基因毒性事件较少，如p53激活和大量缺失。碱基编辑在其编辑和产品中更加一致-这是临床治疗非常理想的安全特性。传统的Cas9会产生不受控制的插入和删除突变混合物，称为“indel”，与之相反，碱基编辑会产生精确的核苷酸变化，几乎没有不需要的副产物。

Weiss说:“在我们的比较中，我们发现了传统Cas9核酸酶意想不到的问题。”“我们有些惊讶的是，并非每次Cas9插入或删除都能在相同程度上提高胎儿血红蛋白，这表明该技术可能会产生异质生物学结果。”该研究小组发现，与碱基编辑处理的细胞相比，用相同的Cas9处理的造血干细胞衍生的单个红细胞产生的胎儿血红蛋白数量变化更大。因此，碱基编辑产生了更有效、可靠和一致的结果，这是理想的治疗特性。

尽管碱基编辑表现良好，但研究人员尚未确定其在患者中的安全性。值得注意的是，碱基编辑可能存在Cas9所没有的一些风险;例如，一些早期的碱基编辑器可能会在非目标位点引起基因组DNA或RNA的不希望的变化。该小组表明，这些变化相对较小，预计不会有害，但有必要进行更深入的研究，以全面评估这些风险。

基因编辑疗法的未来

在整个研究中，科学家们直接比较了Cas9核酸酶在两个不同靶点上的表现，这些靶点以不同的方式诱导胎儿血红蛋白的产生和碱基编辑。碱基编辑使用一种独特的编辑机制，直接将一个DNA碱基对转化为另一个，而不是将DNA双螺旋切割成两段。

Cas9核酸酶方法会产生缺失和插入的混合物，从而损害BCL11A的表达或活性，BCL11A是一种众所周知的γ -珠蛋白基因抑制因子。相比之下，碱基编辑在γ -珠蛋白启动子内创建了一个新的转录因子结合基序。Cas9核酸酶方法和另一种碱基编辑方法正在通过临床试验进行测试。圣犹达正在参与其中的一些研究。

Weiss说:“测试和比较治疗SCD和-地中海贫血的不同基因组编辑方法是非常重要的，因为最好的方法还不知道。

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Potent and uniform fetal hemoglobin induction via base editing