近日，清华大学药学院储凌课题组在《Journal of the American Chemical Society》发表了题为“Self-Renewable Tag for Photostable Fluorescence Imaging of Proteins”的文章，报道了一种用于蛋白质光稳定荧光成像的荧光自修复蛋白标签（srTAG），该工作作为活细胞蛋白荧光标记方法的强有力补充，能够极大助力细胞内蛋白质运输分布等相关生物问题的研究。

研究背景

随着蛋白质标记技术的发展，活细胞荧光成像已成为研究蛋白质功能和定位的常规工具。而小分子染料的兴起和利用荧光团的位点特异性结合的自标记标签的开发扩大了荧光成像工具箱。与广泛采用的荧光蛋白相比，自我标记蛋白(如HaloTag、SNAP-Tag)提供了更灵活的染料光谱特性选择、更高的亮度和光稳定性。然而，在荧光成像实验中，光漂白在一定程度上限制了空间和时间分辨率以及成像持续时间。

为了实现细胞器的长时间、多色显微成像，Schepartz和Toomre实验室报告了一系列高密度环境敏感（HIDE）探针，能够识别质膜、内质网（ER）、线粒体、高尔基体，并且比相同的荧光团连接到细胞器驻留时间长15-40倍。HIDE探针利用脂质膜的亲脂性环境将罗丹明两性离子/螺环平衡转变为非荧光螺环形式，“隐藏”这一荧光团池以避免光漂白，从而实现长时间超分辨率成像。尽管HIDE探针在某些情况下有用，但它依赖于靶向小分子的细胞器，因此不能推广用于标记感兴趣的蛋白质（图1）。最近，HaloTag7的可逆荧光标记被报道。这些可逆的HaloTags（即xHTLs和reHaloTag）在不同超分辨率显微长时程成像实验中表现出优异的光稳定性。因此，迫切需要发展一种用于长时间同时对多种蛋白质成像的互补方法。

图1. 可再生标签（srTAG）概念的示意图

研究过程与成果

清华大学药学院储凌课题组探索了HIDE探针的概念和可逆交换标记策略是否可以结合起来开发用于蛋白质长时间成像的自标记标签。AP1867是Ariad Pharmaceuticals开发的一种小分子，它能选择性的与野生型FKBP12上的 FK506结合蛋白（FKBP）F36V突变体结合。在本工作中通过将荧光染料JF635与AP1867偶联来合成ZCD-1（图2A），并在瞬时表达FKBPF36V-mEmerald NLS的U2OS细胞进行FRAP实验，结果发现荧光信号能够恢复到初始荧光强度的65%。在初步结果的鼓舞下，又通过评估不同弹头、不同连接体、不同氨基酸突变对共聚焦成像质量和荧光恢复来优化标签, 发现了srTAG (self-renewable Tag) FKBPF36L/ZCD-1（图2B）。

与目前常用的自标记标签相比，srTAG表现出明显的荧光恢复，并给与三次光漂白刺激后能够恢复到原有激光强度的65%（图2C, E）。为了验证srTAG在标记细胞内蛋白质方面的广泛适用性，在表达FKBPF36L与内质网（ER）标记蛋白Sec61β, 线粒体嵴膜蛋白COX8A、线粒体外膜蛋白TOMM20和溶酶体膜蛋白LAMP1融合的活U2OS细胞进行了共聚焦成像。所有成像的蛋白质都给出了预期的分布模式（图2D）。

图2. srTAG在光漂白后荧光信号的自恢复

为了阐明srTAG在超分辨率成像中的作用，作者在表达Lifeact-FKBPF36L和融合Sec61 b的U2OS细胞中进行了活细胞STED成像（图3A,B），结果显示srTAG能够用于超分辨成像，并且能够将分辨率从共聚焦的200nm左右提升到70nm左右（图3C）。与HaloTag相比，srTAG在超分辨STED成像中表现出更好的光稳定性（图3D）。除此之外，srTAG能够与可逆标签reHaloTag兼容进行双色成像（图3E）。

图3. srTAG在超分辨成像中的应用

 细胞核内的m6A识别蛋白YTHDC1会发生液-液相分离，在活细胞中以核点状分布。作者将YTHDC1与不同的标签融合，以检查标签大小是否会影响YTHDC1的分布。表达EGFP、FlAsH或FKBPF36L融合的YTHDC1的U2OS细胞表现为核点状（图4）。然而，Halo-YTHDC1的荧光信号在整个细胞核中扩散（图4）。

图4. srTAG在相分离成像中的应用

在该项工作的最后，作者猜测荧光信号的恢复可能是由于荧光团在蛋白质上的“开/关”平衡或非共价探针的可交换性。为了阐明其机制，首先纯化了重组FKBPF36L蛋白，并将FKBPF36L/ZCD-1复合物固定在盖玻片上。FRAP实验通过全内反射荧光（TIRF）显微镜进行监测。结果显示在没有自由扩散的ZCD-1的情况下观察到荧光的恢复，证实荧光团“在蛋白质上”的平衡有助于荧光的恢复。作为对照，纯化的Halo/JF635-CA复合物在光漂白后没有恢复荧光信号（图5A）。另一方面，为了研究探针交换是否也有助于FRAP现象，首先用ZCD-1孵育表达NLS-FKBPF36L的U2OS细胞，然后替换为含有ZCD-7的培养基。结果显示在532nm通道中出现荧光信号和在633nm通道中信号减弱，表明ZCD-1探针被ZCD-7交换（图5B）。

图5. srTAG的“开/关”平衡和可交换性的机制研究

研究意义

该课题组开发了一种用于蛋白质光稳定荧光成像的荧光自修复蛋白标签（srTAG）。利用了荧光两性离子和非荧光螺环形式之间的“蛋白质上”荧光团平衡，以及非共价探针的可交换性。该工作发现srTAG在光漂白后自发恢复荧光信号，与具有相同荧光团的Halo和SNAP-tag缀合物相比，漂白半衰期延长2到6倍。除此之外，srTAG概念适用于不同吸收和发射光谱的荧光团。srTAG能够与STED显微成像兼容，可以与其他可交换标签组合进行多色成像实验。此外，与其他自标记标签或荧光蛋白相比，srTAG的尺寸较小（12kDa），对活细胞中的蛋白质运输和分布影响相对较小。因此，这项工作作为可逆标记标签的强有力补充，能够极大助力研究细胞内蛋白质运输分布等相关的生物应用。

该项工作得到了国家重点研发计划（No.2021YFA0910900）、国家青年人才计划和清华大学启动基金的资助。清华大学生命科学院，北京市生物结构前沿研究中心的陈春来教授和清华大学IDG/麦戈文脑研究所，清华-北大生命科学联合中心吝易教授在机制和应用方面提供了大量的帮助。