### 微生物细胞工厂（MCFs）的发展历程与重要性
微生物细胞工厂（MCFs）作为生物制造的关键部分，在生物经济时代意义重大。它能利用生物系统，将可再生原料转化为多种有经济价值的产品，如生物燃料、生化制品、营养物质和药品等，被视为生物制造的 “芯片” 。其发展经历了从自然细胞工厂的发现到人工合成细胞工厂创造的过程，技术的进步推动了这一发展，使其不断迭代升级，以满足工业生产需求。

工业底盘细胞的发展

1. 自然工业微生物的分离与发现：人类对微生物的利用历史悠久，如 5000 年前发现水果自然发酵产生的酸液，进而利用醋酸菌生产醋。20 世纪，能源短缺促使生物丁醇发展，丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）成为重要生产菌株；青霉素的发现开启了抗生素时代，产黄青霉（Penicillium chrysogenum）实现了青霉素的工业发酵生产。此外，还发现了众多能生产各类生化产品的微生物，这些自然获得的菌株构成了第一代工业微生物细胞工厂（MCF 1.0），但它们在产品效价、速率和产量等方面无法满足工业应用需求。
2. 随机诱变和自然选择：由于从自然环境中筛选的微生物信息和遗传工具有限，随机诱变成为改良菌株特性的主要方法，这一时期的细胞工厂发展标志着第二代工业微生物细胞工厂（MCF 2.0）的诞生。随机诱变包括物理、化学和生物诱变。物理诱变利用紫外线（UV）、X 射线等物理因素，如新型诱变工具常压室温等离子体（ARTP），能有效提高生化产品产量；化学诱变使用化学物质诱导突变，但因其毒性对人体健康和环境有风险；生物诱变如噬菌体、质粒、DNA 转座子诱变和原生质体融合等技术，尤其是基因组改组技术，可加速微生物正向突变过程，广泛应用于生物产品菌株的创建。
3. MCFs 的代谢工程：人类基因组计划的成功和技术进步使人们对微生物底盘细胞有了更深入的基因组层面的理解。代谢工程的研究方向转向对模式微生物的改造，如大肠杆菌（Escherichia coli）、酿酒酵母（S. cerevisiae）、谷氨酸棒杆菌（C. glutamicum）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等。这些模式微生物具有遗传背景清晰、生物部件和装置丰富、遗传修饰工具完备等优势，经代谢工程改造后成为第三代工业微生物细胞工厂（MCF 3.0），但将其快速转化为理想的 MCFs 仍面临挑战。
4. 代谢工程的方向和策略
   • 拓宽底物利用：为应对原材料价格波动，开发能利用不同底物的微生物底盘细胞至关重要。木质纤维素是丰富的可再生资源，其水解产生的单糖包括 C5 糖（如木糖、阿拉伯糖）和 C6 糖（如葡萄糖、甘露糖、半乳糖），但多数微生物只能利用特定糖类。通过引入不同碳源的代谢途径和转运系统，结合适应性进化，可实现微生物对多种碳源的共利用，提高底物利用效率，如在酵母中引入外源木糖代谢途径实现木糖生产乙醇。此外，C1 分子（如 CO₂、甲醇、甲酸）也是有潜力的原料，微生物利用 C1 分子的研究不断推进，包括自然甲基营养微生物和经代谢工程改造的菌株，还探索了二氧化碳的生物固定途径。
   • 平衡辅因子和能量：辅因子和三磷酸腺苷（ATP）是能量代谢的关键调节因子，对维持细胞生长和稳态至关重要。细胞代谢底物产生还原力和 ATP，在合成生化产品时也需要它们，若供应不平衡会影响产品转化率和合成效率。调节细胞内 ATP 水平可通过 ATP 相关酶代谢和氧化磷酸化等途径，如在发酵系统中添加能量底物柠檬酸可提高聚 -γ- 谷氨酸（PGA）产量。优化还原力供应可采取调节细胞内还原力合成和再生、改变关键酶辅因子偏好、消耗多余辅因子和引入非天然辅因子等策略，如激活相关酶表达或引入高效产生还原力的代谢途径（如 Entner–Doudoroff 途径，ED 途径）可提高还原力水平和产品产量。
   • 提高稳健性：MCFs 在发酵过程中会受到多种生理或理化应激因素影响，如温度、pH、氧气、渗透压以及底物、抑制剂和有毒中间体或副产物浓度的变化，这些因素会抑制微生物代谢和细胞生长，甚至导致生产性能丧失。传统诱变和适应性实验室进化（ALE）是提高菌株稳健性的有效策略，ALE 可用于提高底盘细胞对有毒物质的耐受性，结合基因组测序和转录组分析能深入了解耐受性机制，还能改善微生物底盘细胞的代谢紊乱。此外，随着组学数据集的积累，越来越多的抗逆元件被发现并应用于构建稳健的微生物，如与细胞壁和细胞膜、DNA 修复、氧化应激、相容性溶质、能量产生和信号转导相关的基因，以及外排泵、热休克蛋白和全局转录因子等，通过基因工程对菌株进行理性改造可提高其稳健性。
   • 重新布线代谢网络：随着底盘菌株生产高产中间产物能力的提高，代谢途径重建的复杂性降低。利用全基因组代谢模型可搜索代谢工程的遗传靶点，设计代谢途径重建文库，并结合高通量生物传感器训练机器学习算法，优化底盘细胞代谢平衡，提高目标产品的合成能力，如在工程酵母中提高了芳香族氨基酸的生产能力。在重塑代谢网络时，要注意各代谢途径间的相互作用，减少引入生物合成途径对辅酶和能量供应的干扰，同时避免异源途径对底盘细胞生理状态和生长速率的负面影响。生物信息学策略的发展有助于对微生物生理代谢功能进行全面系统的分析、设计和调控，基于基因组规模代谢网络模型（GSMM）可预测菌株修饰的遗传靶点，提高重组菌株目标产品的效价、产量和生产速率。
   
   
5. 合成生物学指导的工业微生物底盘细胞改造：模式微生物在利用低成本原料时存在发酵性能差等缺点，限制了其在木质纤维素生化生产中的应用。随着系统和合成生物学的发展，更多具有优良工业特性的非模式微生物底盘细胞被探索，如运动发酵单胞菌（Z. mobilis）、解脂耶氏酵母（Y. lipolytica）、噬盐菌（H. bluephagenesis）等，它们可作为经济生化生产的底盘细胞。合成生物学为构建功能性合成细胞工厂提供了强大工具，通过有效基因编辑、合成和组装工具，可构建稳健高效的工业菌株，满足工业需求。
6. 丰富生物组件和开发使能技术
   • 生物部件的表征和应用：生物部件是合成生物学的基本要素，包括启动子、终止子、转录单元、质粒等 DNA 序列以及核糖体结合位点（RBS）等 RNA 序列。挖掘、鉴定和修饰生物组件是合成生物学的重要研究方向，越来越多的生物部件被应用于调节代谢网络通量、提高目标产品产量和减少副产物生成，如构建不同强度的启动子文库和设计具有不同翻译水平的人工 RBS 序列，同时还开发了一系列分析工具用于预测和设计生物部件。
   • 基因电路：基因电路包括转录基因调控电路和基于蛋白质的信号电路。转录基因调控电路通过转录控制基因表达，如 T7 RNAP、LacI 和 TetR 等广泛应用的调控电路，以及基于转录因子与特定代谢物和启动子区域 DNA 结合的动态调控系统，可调节 MCFs 的代谢网络。随着对微生物群体感应（QS）机制研究的深入，基于 QS 的动态调控被用于解耦细胞生长和生产过程，应用于多种产品的生产。
   • 开发和优化基因组编辑策略：对于 MCFs 的工业应用，染色体表达生物合成基因比质粒表达更稳定。锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活样效应核酸酶（TALENs）和基于 CRISPR-Cas 系统的技术是重要的基因编辑工具。CRISPR-Cas 系统因其精确性和快速性受到广泛关注，在多种微生物中得到应用和优化，包括模式微生物和非模式微生物，为基因组编辑和高效细胞工厂的构建提供了多样化的遗传工具。
   • 基因组最小化：基因组最小化是构建优良底盘细胞的重要策略，通过敲除冗余基因可降低细胞能量消耗，使更多能量用于目标产品生产。多种微生物经基因组最小化后表现出优良特性，如提高转化效率、遗传稳定性、细胞生长速率和产品产量等。
   • 高通量筛选：高通量筛选可快速从大量变异文库中获得所需突变体。传统微孔板筛选方法结合自动化设备可提高筛选效率，此外，荧光标记、质谱、单细胞拉曼光谱（SCRS）和液滴微流控等技术也被应用于高通量筛选。SCRS 技术可在单细胞水平识别功能表型，液滴微流控可实现单细胞代谢物浓度的定量监测和精确操作，结合微流控技术、光电传感和自动化技术开发的微生物微滴培养系统（MMC）可加速微生物底盘细胞的进化，提高获得优良表型样本的效率。
   • 人工智能：计算机辅助设计（CAD）可提高生物部件和系统的设计能力和质量，人工智能（AI）或计算生物学可实现生物部件、电路、途径和系统的理性设计，提高生物表达和生产效率。例如，AI 算法可设计和优化启动子序列，计算生物学方法可模拟和预测酶的表达水平和功能，帮助优化代谢工程设计，指导高效 MCFs 的构建和发展。
   
   
7. 定制人工细胞工厂的创建：微生物细胞知识库的发展、AI 和自动化技术的进步使底盘细胞的设计、合成和测试更加智能，减少了工业底盘细胞开发过程中的试错频率。基于大量组学数据和 AI 技术，可高效发现和分析基因组中未知功能的基因，通过修饰基因型相关表型获得定制的工业底盘细胞，即第五代工业微生物细胞工厂（MCF 5.0）。MCFs 的定制设计可基于海量数据资源，采用生物设计自动化，通过算法预测和筛选生物合成途径、设计调控组件和途径，并评估途径与底盘的适应性，实现从遗传组件的局部修饰到新创造的全面发展，促进生物经济的绿色可持续发展。
8. 工业数字 MCFs 的未来展望：尽管在构建细胞工厂合成生化产品方面取得了一定成果，但目前多数目标产品的合成仍未达到工业生产要求，需要在产量和生产力上取得突破。未来需进一步探索生化产品生物合成途径中的关键生物组件，设计和重构底盘细胞的代谢模式，优化合成途径与代谢网络的适应性，结合过程工程技术和智能控制策略支持发酵过程。随着系统和合成生物学的发展，生物技术与信息技术的交叉融合将为高效 MCFs 的构建和优化提供更多工具和资源。AI 在合成生物学中发挥着越来越重要的作用，如在蛋白质设计方面取得的成功，其预测和开发蛋白质的能力可进一步应用于高效 MCFs 的发展。随着自动化、信息技术和生物技术的进一步发展和交叉融合，发酵过程的优化和控制将更加智能，有望实现定制人工细胞工厂的高效、绿色和低成本合成，推动经济生化生产和商业化发展。
9. 结论：细胞工厂的发现和创造是一个漫长的过程，从最初依赖大量人力到借助高效工具加速 MCFs 的迭代更新。模式和非模式微生物的应用与发展推动了 MCFs 的工业应用，合成生物学的出现为 MCFs 带来了革命性变革。在 AI 时代，MCFs 的构建和优化需要先进的生物技术与强大的数字技术相结合，以降低成本。在多种生物技术和 AI 的支持下，MCF 5.0 将展现出更优异的性能和更智能的形态。

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