《Journal of Nanobiotechnology》：Nano-delivery platform with strong protection and efficient delivery: preparation of self-assembled RNA pesticide with dual RNAi targets against Apolygus lucorum
编辑推荐：
为解决双链 RNA（dsRNA）在环境中易降解、递送效率不足影响害虫防治的问题，研究人员开展了构建基于星型聚阳离子（SPc）的递送平台并开发自组装双 RNA 干扰（RNAi）靶点 RNA 杀虫剂的研究。结果显示该平台能有效保护和递送 dsRNA，显著抑制绿盲蝽生长发育。这为新型 RNA 杀虫剂设计提供了参考。
在农业生产的大舞台上，绿盲蝽（Apolygus lucorum）可谓是个 “大反派”。它作为重要的刺吸式农业害虫，凭借着强大的 mobility、广泛的寄主范围和让人捉摸不透的取食特性，给农作物带来了严重的破坏。过去二十年，它对中国农田里的 Bt 棉花造成了极大损害。传统的杀虫剂使用方式既不科学，又容易让昆虫产生抗药性，还会对环境造成潜在危害。
RNA 干扰（RNAi）技术的出现，就像给农业害虫防治带来了一道曙光。它能通过双链 RNA（dsRNA）诱导同源 mRNA 的高效特异性降解，在害虫基因功能分析、生理生化过程解析等方面大显身手，还能助力识别杀虫剂靶标分子和潜在抗性机制，成为可持续害虫治理的新策略。然而，这一技术在实际应用中却遇到了 “拦路虎”。在半翅目等昆虫中，RNAi 效率较低，主要原因包括 dsRNA/siRNA 缺乏有效的递送方法、会被双链核糖核酸酶（dsRNases）降解以及 RNAi 机制存在缺陷。现有的 dsRNA 递送方法，如显微注射和喂食，不仅不适合田间应用，而且在不同昆虫物种中的 RNAi 效率差异很大。此外，转基因植物表达发夹 RNA（hpRNAs）的方法也受到植物内源性 RNAi 机制的限制，无法有效控制害虫。因此，开发一种高效的 dsRNA 递送方法，成为设计和开发非转化型 RNA 杀虫剂的关键。
为了攻克这些难题，江苏省农业科学院植物保护研究所等机构的研究人员开展了深入研究。他们旨在构建一个基于星型聚阳离子（SPc）的递送平台，开发具有双 RNAi 靶点的自组装 RNA 杀虫剂。
研究人员用到了多个关键技术方法：一是化学合成技术，合成了 SPc；二是分子生物学技术，提取昆虫总 RNA 并合成 cDNA，扩增目标基因片段用于 dsRNA 合成；三是通过凝胶阻滞试验、等温滴定量热法（ITC）等分析 dsRNA 与 SPc 的相互作用；四是借助透射电子显微镜（TEM）、原子力显微镜（AFM）等对 dsRNA/SPc 复合物进行表征；五是利用 RNA 测序（RNA-seq）分析基因表达变化。
下面来看具体的研究结果：
dsGFP/SPc 复合物的自组装机制和表征 ：通过凝胶阻滞试验和 ITC 分析发现，dsGFP 与 SPc 在室温下孵育 15 分钟可自组装形成复合物，静电相互作用、氢键和范德华力在其中发挥重要作用。TEM 和 AFM 图像显示，dsGFP 呈线性，SPc 为典型球形，二者结合形成的复合物粒径为 198.57nm，zeta 电位为 6.54mV，证实 SPc 能与 dsGFP 成功相互作用形成稳定纳米颗粒。SPc 对 dsRNA 的强保护作用 ：实验表明，单独的 dsRNA 会被绿盲蝽中肠液或 RNase A 迅速降解，而 SPc 能保护 dsGFP 不被降解。在不同 pH 环境下，SPc - 负载的 dsGFP 在 pH 2 - 12 范围内保持稳定，在 pH 13 - 14 时才会被切割，且在 pH 2 - 7 的溶液中孵育后仍具有良好的转染效率。此外，在不同温度下，dsGFP/SPc 复合物也能适应田间温度变化。SPc 增强 dsRNA 的递送效率 ：用 Cy3 -dsGFP/SPc 复合物对绿盲蝽若虫进行局部涂抹和口服喂养实验，结果显示，与 Cy3 -dsGFP 和 SPc 单独处理相比，复合物处理的若虫荧光强度显著更高，表明 SPc 不仅能提高 dsRNA 在肠道中的稳定性，还能帮助其穿透角质层屏障进行扩散。同时，SPc - 负载的 dsRNA 在植物中的摄取效率也更强，荧光强度更高。高效 dsRNA 片段筛选 ：研究人员合成了绿盲蝽中 AlECR - A 和 AlTre - 1 基因的多个 dsRNA 片段，经局部涂抹处理后发现，dsECR - A3 和 dsTre1 - 1 能显著降低目标基因表达水平，提高若虫死亡率，分别达到约 40% 和 50%。因此，选择这两个片段进行后续实验。SPc - 负载的 dsECR - A + Tre - 1 的协同机制 ：对处理后存活若虫进行 RNA - seq 分析，结果显示，与 dsECR - A + Tre - 1 单独处理相比，dsECR - A + Tre - 1/SPc 复合物处理后改变了 1260 个基因的表达，包括 712 个上调基因和 548 个下调基因。这些差异表达基因（DEGs）涉及精氨酸和脯氨酸代谢、溶酶体、碳代谢、糖酵解 / 糖异生、ABC 转运体、内吞作用等多种基因通路。进一步研究发现，处理后许多生长发育相关基因显著下调，如 Tre - 1、ECR - A 等，同时一些与内吞作用相关的基因上调，有利于细胞对 dsECR - A + Tre - 1 复合物的摄取。此外，处理后绿盲蝽的海藻糖酶活性降低，海藻糖含量升高，葡萄糖含量降低，影响其生长发育。
研究结论和讨论部分指出，研究人员成功设计并构建了基于 SPc 递送系统和大肠杆菌表达系统的针对绿盲蝽的高效 RNA 杀虫剂。SPc 能与 dsRNA 自发组装形成稳定复合物，有效保护 dsRNA 并提高其在昆虫和植物中的递送效率。筛选出的 dsECR - A 和 dsTre - 1 片段共表达制备的 dsECR - A + Tre - 1/SPc 复合物，通过局部涂抹和喷雾处理对绿盲蝽均有良好的防治效果。该研究全面展示了基于 SPc 的 dsRNA 递送系统的优势，为新型 RNA 杀虫剂的设计和开发提供了高效平台，有望推动农业害虫防治领域的发展，为实现绿色农业、减少化学农药使用提供有力支持。
打赏
下载安捷伦电子书《通过细胞代谢揭示新的药物靶点》探索如何通过代谢分析促进您的药物发现研究
10x Genomics新品Visium HD 开启单细胞分辨率的全转录组空间分析！
欢迎下载Twist《不断变化的CRISPR筛选格局》电子书
单细胞测序入门大讲堂 - 深入了解从第一个单细胞实验设计到数据质控与可视化解析
下载《细胞内蛋白质互作分析方法电子书》
