《Journal of Biological Engineering》：Droplet microfluidic screening to engineer angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) catalytic activity
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为解决传统高通量筛选方法无法精准模拟天然底物，难以发现高效 ACE2 变体的问题，研究人员开展了利用液滴微流控平台筛选 ACE2 变体的研究。结果发现 K187T 变体催化效率提升四倍，该研究为治疗相关疾病提供了新方向1212。
在人体复杂的生理调控网络中，血管紧张素转化酶 2（Angiotensin-Converting Enzyme 2，ACE2）扮演着极为关键的角色。它作为一种重要的肽酶（peptidase），参与了人体肽激素信号传导过程。ACE2 能够催化血管紧张素 II（Angiotensin-II，Ang-II）转化为血管紧张素 -(1–7)，激活 Mas 受体（MasR） ，进而引发一系列对人体有益的生理反应，如血管舒张、血流量增加、炎症减轻以及病理组织重塑的抑制。
正因如此，ACE2 在治疗多种疾病方面展现出了巨大的潜力，像是呼吸道病毒感染、急性呼吸窘迫综合征（Acute Respiratory Distress Syndrome）以及糖尿病等。然而，想要充分发挥 ACE2 的治疗作用，却面临着诸多挑战。传统的高通量筛选方法在筛选肽酶时，常常依赖化学修饰的肽，这些肽无法精准地模拟天然底物的形状和化学特性。这就导致筛选出来的酶变体，在实际作用于天然肽底物时效果不佳，极大地限制了人们发现活性更高的肽酶变体，使得 ACE2 在临床应用中的优化进程受阻。
为了突破这些困境，来自美国威斯康星大学麦迪逊分校（University of Wisconsin-Madison）和杜克大学（Duke University）的研究人员展开了一项极具意义的研究。他们致力于开发一种全新的技术，以实现对 ACE2 变体的高效筛选，期望能够找到活性更强的 ACE2 变体，为相关疾病的治疗带来新的希望。最终，这项研究取得了令人瞩目的成果，其相关论文发表在了《Journal of Biological Engineering》上。
研究人员在此次研究中，运用了多种关键技术方法。首先是酵母表面展示技术，通过将 ACE2 基因克隆到酵母表面展示载体，让酵母展示 ACE2 变体。其次是液滴微流控技术，该技术能够将生物检测反应在皮升规模的油包水乳液中进行分隔，实现对大量细胞和生物分子的超高通量分析。研究人员利用这一技术，将酵母细胞与 Ang-II 底物及检测试剂封装在微滴中，进行后续的筛选分析。此外，还借助了下一代测序（Next Generation Sequencing，NGS）技术，对筛选前后的 ACE2 基因进行测序，分析突变情况345。
下面来详细看看研究结果：
- 微流控平台用于天然肽底物上的肽酶筛选：研究人员成功开发了一种微流控筛选平台，用于在肽底物上筛选 ACE2 及其他肽酶。该平台将展示 ACE2 变体的酵母细胞与 Ang-II 底物及检测底物水解的试剂封装在微滴中，孵育一段时间后，通过检测微滴的荧光信号来筛选出活性高的 ACE2 变体。为了更准确地检测 ACE2 对天然底物的催化活性，研究人员还开发了一种耦合酶检测方法，能够检测 Ang-II 裂解后释放的游离苯丙氨酸。通过实验验证，该检测方法可以可靠地检测 ACE2 的活性。此外，研究人员进行了模拟分选实验，结果显示该平台能够将活性 ACE2 富集 5 倍，证明了其在筛选大量 ACE2 变体方面的能力67。
- ACE2 的突变扫描以发现增强活性的突变：研究人员利用易错 PCR（Error Prone PCR）技术在 ACE2 肽酶结构域基因中引入随机突变，构建了 ACE2 突变文库。然后使用微流控系统对文库进行筛选，并对筛选前后的酵母细胞进行 DNA 测序分析。通过计算单个氨基酸替换的对数富集值，研究人员发现实验重复之间存在相当大的变异性。不过，他们还是确定了一些在所有重复实验中都显示出有益效果的突变，其中 K187Q 突变的 ACE2 活性比野生型高出 1.5 倍89。
- 赖氨酸 187 作为增强 ACE2 催化活性的突变热点：研究人员对 K187Q 突变进行深入研究，通过饱和诱变测试了 187 位所有可能的氨基酸替换。结果发现多个氨基酸替换能够增强 ACE2 的总活性，其中 K187T 变体的总活性比野生型高出 2 倍以上 。进一步的研究表明，这些活性差异并非由酵母表面酶拷贝数的变化引起，而是由于酶的催化常数（kcat）和米氏常数（KM）的改善。通过 Michaelis-Menten 动力学测量发现，K187T 的催化效率（kcat/KM）比野生型 ACE2 提高了 3.6 倍1011。
在研究结论和讨论部分，此次研究意义非凡。一方面，研究人员开发的超高通量液滴微流控系统，为筛选肽酶提供了一种新的有力工具。该系统能够使用天然肽底物进行筛选，更准确地反映肽酶的生物学活性，有助于发现更多具有潜在治疗价值的肽酶变体。另一方面，研究发现的 K187T 等变体，其催化效率的显著提升，为 ACE2 在临床治疗中的应用提供了新的候选分子。尤其是在生理 Ang-II 浓度下，K187 突变体显示出了更好的活性，为改善相关疾病的治疗效果带来了希望。然而，研究也存在一些局限性，比如实验重复之间的变异性问题，可能与液滴检测或微流控分选有关。后续研究可以针对这些问题进行优化，进一步完善该筛选平台，推动肽酶工程在医学领域的广泛应用，为更多患者带来福音。
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