《SCIENCE ADVANCES》:Decoding aptamer-protein binding kinetics for continuous biosensing using single-molecule techniques
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本文利用单分子技术解码适体 - 蛋白质结合动力学,通过单分子荧光共振能量转移(smFRET)等方法,研究不同适体与凝血酶的结合特性,结合计算模拟和石英晶体微天平(QCM)实验,为适体生物传感器的合理设计提供依据,推动生物传感领域发展。
引言
生物传感器在健康监测和疾病检测中意义重大,实时连续的生物传感对于捕捉生物过程变化至关重要。适体作为新型生物识别元件,相比传统的抗体和酶,具有生产成本低、修饰简便、结合亲和力高、选择性强以及可重复使用等优势,在生物传感领域应用广泛。然而,目前适体在传感器系统中的成功应用仍有限。现有研究方法在量化适体 - 靶标相互作用时存在诸多局限,如样本消耗大、灵敏度受限、掩盖亚群异质性等,因此需要新的技术来准确量化这种相互作用。本文通过构建单分子荧光平台,以凝血酶 - 适体对为研究对象,对结构相似的适体 HD1、RE31 和 NU172 进行研究,旨在解码适体 - 蛋白质的结合动力学,为适体生物传感器的合理设计提供指导。
结果
- 单分子适体表征实验:为精确量化适体 - 蛋白质相互作用,设计了一种单分子检测方法。将受体(Cy5)标记的凝血酶蛋白通过生物素 - 亲和素结合固定在聚合物涂层的石英载玻片上,然后注入供体(Cy3)标记的适体,利用全内反射(TIR)荧光显微镜监测适体与凝血酶的结合情况。实验对比了用 N - 羟基琥珀酰亚胺钠盐(NHS)标记所有胺基的凝血酶和用 2 - 吡啶甲醛(2PCA)标记 N 端的凝血酶的单分子荧光共振能量转移(smFRET)数据。结果显示,2PCA 标记的凝血酶能实现位点特异性荧光标记和蛋白质固定,其 FRET 直方图峰形尖锐,对应适体在距 N 端固定距离处的结合事件;而 NHS 标记的凝血酶 FRET 直方图呈现异质性,可能是由于标记不同赖氨酸残基导致受体荧光团位置可变,且可能影响了适体与靶蛋白的相互作用。
- 不同凝血酶适体的结合动力学区分:选用与凝血酶外位点 I 结合的 HD1、RE31 和 NU172 三种适体,它们结构不同,FRET 效率也不同。实验测得 RE31(2.9±0.1 nM)和 NU172(3.3±0.7 nM)的解离常数(Kd)低于 HD1(9.2±0.8 nM)。进一步通过 smFRET 检测测定结合和解离速率,发现 HD1 的解离速率(koff = 0.7±0.1 s-1)至少是 RE31(koff = 0.3±0.1 s-1)和 NU172(koff = 0.1±0.1 s-1)的两倍,且 RE31 的结合速率(kon = 1.1±0.1×108 M-1 s-1)比 HD1(kon = 0.7±0.1×108 M-1 s-1)快,但 NU172(kon = 0.2±0.1×108 M-1 s-1)却并非如此,这表明适体序列的差异会导致结合动力学的不同。
- 基于单分子数据的适体选择用于实时连续传感平台:利用质量敏感的石英晶体微天平(QCM)作为连续监测生物传感平台的代表,通过 COMSOL 模拟研究了凝血酶浓度、流速、kon和koff等参数对传感器响应的影响。模拟结果表明,流速增加会使传感器响应更快,凝血酶浓度与适体 - 凝血酶复合物形成速率呈正比,kon在模拟时间内对传感器响应影响不大,而koff显著影响捕获和解离行为,高koff值会使传感器响应大幅降低,低koff值下凝血酶不易释放。基于 smFRET 测量得到的kon和koff值进行模拟,预测 NU172 在传感器中的灵敏度最高。QCM 实验结果验证了模拟结论,在 1.65 - 16.5 nM 范围内,NU172 的灵敏度约为 RE31 的两倍,且在 300 pM 时仍有响应,而 RE31 在该浓度下无明显频率变化。此外,QCM 实验还表明 RE31 的解离速率高于 NU172,且通过优化再生方法,使用 8 M 尿素缓冲液和 NaOH 再生缓冲液可提高 NU172 适体传感器的再生效率。
讨论
本研究开发的单分子检测方法能够区分具有相似结合亲和力的适体的潜在结合动力学,直接可视化凝血酶与其适体之间相互作用的瞬态性质,揭示了相似亲和力适体结合机制的细微差异,为生物传感器应用中适体的合理选择提供了有力工具。研究发现,在实时连续监测平台中,较低koff的适体(如 NU172)能提高传感器灵敏度,这表明除了亲和力(Kd),动力学参数尤其是koff在决定生物传感器效率方面起着更关键的作用。COMSOL 模拟结合 smFRET 实验数据,有助于预测适体在传感应用中的性能,但该模拟存在理想化假设,需要结合实验进行验证。在 QCM 实验中,适体传感器的再生受其整体传感性质限制,可通过改进传感器表面组装和优化再生方法(如调整再生时间和缓冲液成分)来提高再生能力。此外,利用双功能 2PCA - DBCO 接头对蛋白质 N 端进行位点特异性标记,简化了实验流程,有利于对天然来源蛋白质进行分析。本研究通过单分子技术深入了解适体结合动力学,为克服适体生物传感器临床应用的挑战提供了重要指导,有望推动基础研究和临床诊断的发展。
材料和方法
- N 端修饰:合成 2PCA - DBCO 双功能接头,将其与凝血酶蛋白反应,再用叠氮 - Cy5 - 生物素标记,最后通过 Zeba Spin 脱盐柱纯化。
- NHS 标记蛋白质:用 NHS - DBCO 标记凝血酶,再用叠氮 - Cy5 - 生物素标记,同样通过 Zeba Spin 脱盐柱纯化。
- 单分子实验装置:搭建定制显微镜系统,包括倒置显微镜、激光、物镜、滤光片、二向色镜和电子倍增电荷耦合器件(EM - CCD)相机,用于收集荧光信号。
- 单分子数据采集:制备单分子流动池,依次孵育中性亲和素、标记蛋白和标记适体,在室温下进行 smFRET 实验。
- 数据分析:用 Python 编写的自定义脚本分析荧光图像,提取时间轨迹,计算解离速率(koff)、结合速率(kon)、解离常数(Kd)和表观 FRET 效率。
- COMSOL 模拟:使用 COMSOL Multiphysics 6.1 对凝血酶与适体功能化 QCM 传感器的质量传输和表面反应动力学进行建模,设置相关参数并进行模拟,分析结果。
- QCM 实验:使用 Biolin Scientific 的 QCM 设备进行实验,通过自组装单分子层(SAM)形成、EDC - NHS 活化等步骤组装传感器,进行灵敏度测量、解离实验和再生实验,并对数据进行处理和分析。
- 统计和可重复性:在数据处理和过滤过程中,根据质量、事件数量和 FRET 效率等标准排除部分数据。使用 Bootstrapping 和 10 折交叉验证确定置信区间和预测区间,所有实验至少重复三次,统计分析基于 95% 置信区间的 t 检验。
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