在人体这个奇妙的 “小宇宙” 里，大脑无疑是最为神秘且关键的 “星球”。一旦大脑遭遇缺血性损伤，就如同星球陷入了可怕的危机，各种问题接踵而至。其中，肽基精氨酸脱亚氨酶 4（Peptidylarginine deiminase 4，PAD4）在这一过程中所扮演的角色，一直让科研人员们充满好奇又困惑不已。

PAD4 是一种能对蛋白质进行特殊修饰的酶，它可以把蛋白质中带正电荷的精氨酸残基变成中性的瓜氨酸残基，这个过程被称为瓜氨酸化（Citrullination）。别小看这个变化，它可引发一系列连锁反应。比如，它能触发中性粒细胞胞外陷阱（Neutrophil extracellular traps，NETs）形成，这是中性粒细胞的一种特殊死亡方式，会释放出 NETs。而且，异常的 PAD4 活性和蛋白质瓜氨酸化与好多疾病都有关系，像类风湿关节炎、多发性硬化症、阿尔茨海默病，还有恶性肿瘤等。在中枢神经系统相关疾病里，它们也常常 “兴风作浪”。就拿缺血性中风来说，之前的研究发现，中风会让 PAD4 表达上调，引发很多蛋白质瓜氨酸化，可这些变化背后的具体机制，还有 PAD4 在其中到底起什么作用，大家还不是很清楚。这就好比在黑暗中摸索，虽然看到了一些光亮，但前方的路依旧迷雾重重。为了拨开这层迷雾，来自仁荷大学医学院（Inha University School of Medicine）的研究人员展开了深入探索，他们的研究成果发表在了《Acta Neuropathologica Communications》期刊上，论文题目是 “Blocking peptidyl arginine deiminase 4 confers neuroprotective effect in the postischemic brain through both NETosis-dependent and -independent mechanisms” 。这项研究就像是一把钥匙，为我们打开了理解 PAD4 在缺血性大脑中作用的大门，发现抑制 PAD4 能对缺血性大脑起到很强的保护作用，这一发现为相关疾病的治疗带来了新的希望。

为了搞清楚 PAD4 的 “秘密”，研究人员用到了好几种关键技术方法。他们首先建立了大脑中动脉闭塞（Middle cerebral artery occlusion，MCAO）的动物模型，通过这个模型来模拟大脑缺血的情况。然后，运用免疫印迹分析技术，检测不同时间点大脑组织和血清中 PAD4、瓜氨酸化组蛋白 H3（citrullinated histone H3，CitH3，是 NETosis 的标志物）等蛋白质的水平变化，就像是给这些蛋白质做 “体检”，看看它们在缺血过程中有什么变化。免疫荧光染色技术也派上了大用场，它能帮助研究人员观察 PAD4 在不同脑细胞中的分布位置，了解它到底 “藏” 在哪里。还有行为学测试，比如改良神经功能缺损评分（Modified Neurological Severity Score，mNSS）和转棒测试，通过这些测试来评估动物的神经功能和运动能力，看看大脑缺血后动物的身体状况有没有受到影响。

下面来看看研究人员都有哪些重要发现吧。

1. 缺血性大脑中 PAD4 诱导的时间变化：研究人员利用短暂性 MCAO 动物模型，观察 PAD4 在缺血性大脑中的 “动态变化”。他们发现，在缺血半球的皮质半暗带，PAD4 水平在 MCAO 术后 6 小时开始显著上升，到 24 小时达到高峰，之后慢慢下降；而在皮质核心区域，PAD4 在术后 3 - 6 小时明显上调，随后又大幅下降，甚至低于基线水平。同时，血清中的 PAD4 水平在术后 6 小时也开始增加，一直持续上升到 96 小时。这就好像 PAD4 在大脑缺血后，在不同区域和时间有着不同的 “行动轨迹”，它在大脑里忙忙碌碌，似乎在进行着一些不为人知的 “计划”。

2. 缺血性大脑中瓜氨酸化组蛋白 H3（NETosis）的延迟诱导：看到 PAD4 有这么大的变化，研究人员接着探究 NETosis 的诱导情况。结果发现，在大脑皮质半暗带和核心区域，CitH3 水平在 MCAO 术后 48 - 96 小时显著增加，这表明 NETosis 在大脑组织中出现了延迟诱导。而且，从外周血分离的中性粒细胞中，CitH3 和髓过氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）水平在术后 48 小时也开始上升，96 小时进一步增加，血清中游离双链 DNA（dsDNA，也是 NETosis 的标志物）的含量在术后 24 小时开始增多，48 - 96 小时增加更明显。通过免疫荧光染色还发现，在术后 48 小时，PAD4 定位在中性粒细胞中，到 96 小时，能看到典型的 NETotic 形态。这一系列结果说明，缺血性中风后，中性粒细胞激活和 NETosis 诱导大概发生在 48 - 96 小时，而且 PAD4 在这个过程中可能起着重要作用。

3. 缺血性大脑中 PAD4 主要在神经元中诱导表达：为了弄清楚是哪些细胞在表达 PAD4，研究人员进行了三重免疫荧光染色。在假手术对照组里，PAD4 主要存在于大多数神经元（NeuN 阳性细胞）的细胞质中。在 MCAO 术后 24 小时，缺血半球皮质半暗带的 PAD4 免疫反应性明显增强，而皮质核心区域则显著下降。在半暗带，PAD4 主要集中在神经元细胞质的核周区域，呈现出点状和不规则的分布。有意思的是，有些神经元的形态发生了改变，PAD4 免疫反应性也降低了。此外，研究人员还发现，PAD4 也存在于一些非神经元细胞（主要是小胶质细胞）中，并且在细胞外空间也能检测到 PAD4 的免疫反应性。这说明 PAD4 主要定位于神经元的细胞质中，在小胶质细胞中也有少量分布。

4. 早期抑制 PAD4 对缺血后的神经保护作用呈剂量依赖性：既然 PAD4 在缺血性大脑中有这些变化，那抑制它会怎么样呢？研究人员给 MCAO 动物鼻内注射 PAD4 抑制剂 BB - Cl - amidine hydrochloride（BBCA）。结果发现，不同剂量的 BBCA 都能减少梗死体积，而且剂量越大，效果越明显，这说明 BBCA 的神经保护作用是剂量依赖性的。同时，BBCA 还能改善动物的神经功能缺损评分和运动功能，让动物的身体状况变得更好。这就像是给受伤的大脑 “吃” 了一颗有效的 “保护药”，能减轻大脑的损伤。

5. 缺血性大脑中瓜氨酸化蛋白质在退化神经元中积累：研究人员用 F95 抗体进行免疫荧光染色，来观察瓜氨酸化蛋白质的积累情况。在假手术对照组中，瓜氨酸化蛋白质的免疫反应性很弱。但在 MCAO 术后 12 - 24 小时，皮质半暗带神经元中的瓜氨酸化蛋白质免疫反应性明显增强，而且在受损、退化的神经元中也能检测到。不过，鼻内注射 BBCA（50 μg/kg）能显著抑制这种积累。这表明瓜氨酸化蛋白质会在退化神经元中积累，而 BBCA 能阻止这种积累，这可能就是 BBCA 发挥神经保护作用的一个重要原因。

6. 抑制 PAD4 对皮质神经元抗氧糖剥夺和兴奋性毒性有保护作用：在体外实验中，研究人员对原代皮质神经元进行氧糖剥夺（Oxygen - glucose deprivation，OGD）和 N - 甲基 - D - 天冬氨酸（N - methyl - D - aspartate，NMDA）处理，模拟大脑缺血和兴奋性毒性的情况。结果发现，OGD 和 NMDA 处理都会使 PAD4 水平升高，而预先用 BBCA 处理能剂量依赖性地保护神经元，减少细胞死亡。用小干扰 RNA（siRNA）沉默 PAD4 表达，也能显著抑制 OGD 或 NMDA 诱导的神经元死亡。这说明抑制 PAD4 能直接保护原代皮质神经元，抵抗 OGD 和兴奋性毒性介导的神经元死亡。

7. 抑制 PAD4 能直接抑制脑缺血后延迟的 NETosis：研究人员发现，在 MCAO 术后立即（0 小时）或术后 48/72 小时鼻内注射 BBCA（50 μg/kg），都能显著抑制术后 96 小时 CitH3 的诱导，减少中性粒细胞中 CitH3 的表达，降低血清中游离 dsDNA 的水平，这表明延迟抑制 PAD4 能直接抑制 MCAO 术后 96 小时观察到的 NETosis 诱导，而且这种抑制作用和之前的神经保护作用是相互独立的。

8. 抑制 PAD4 减轻脑缺血后血管损伤并促进血管修复：之前的研究表明，抑制 NETosis 能保护血管并促进其修复。研究人员通过免疫染色发现，在 MCAO 术后 48/72 小时给予 BBCA，能恢复血管的密度和总长度，减少 IgG 外渗和 FITC - 葡聚糖渗漏，降低血管通透性，减轻血管损伤，促进功能性血管修复。这说明抑制 PAD4 可能通过抑制延迟的 NETosis，对缺血性大脑的血管起到保护和修复的作用。

综合这些研究结果，我们可以看到，PAD4 在缺血性大脑中扮演着十分复杂的角色。在急性到亚急性期，抑制 PAD4 能减少梗死体积，改善神经和运动功能，减轻神经元损伤，这可能和它抑制蛋白质瓜氨酸化，减少细胞毒性有关。而在后期，抑制 PAD4 能抑制延迟的 NETosis，减轻血管损伤，促进血管修复，对维持大脑微环境的稳定意义重大。这项研究首次详细阐述了 PAD4 在缺血性大脑中的作用，把 PAD4 作为一个潜在的治疗靶点提了出来，为治疗缺血性中风等中枢神经系统疾病带来了新的方向。不过，目前的研究还存在一些不足，比如没有明确特定蛋白质瓜氨酸化和神经元死亡之间的直接因果关系，未来还需要进一步深入研究，探索 PAD4 在其他中枢神经系统疾病中的作用，找到更多的治疗靶点，为人类的健康事业贡献更多的力量。