新冠研究新发现：血清外泌体中的 “小能手” miR-20b-5p

2019 年底，新冠病毒（SARS-CoV-2）突然来袭，迅速在全球掀起一场轩然大波，引发了新冠疫情（COVID-19） 。这场疫情给人类的生命健康带来了极大的威胁，它的症状多种多样，从常见的发热、咳嗽、呼吸困难，到浑身乏力、肌肉酸痛，甚至还会出现恶心呕吐、腹泻等症状。更为严重的是，新冠病毒会引发一系列并发症，像急性呼吸窘迫综合征、肺炎，还有可能导致中风的血栓、肝损伤、心脏损伤、肾脏疾病、神经系统紊乱，以及败血症等，这些并发症往往会使患者的病情急剧恶化，甚至夺走生命。

在新冠重症患者体内，有一个现象引起了科学家们的注意：中性粒细胞（是人体免疫系统的重要组成部分，就像身体的 “卫士”，能够抵御病原体的入侵 ）的数量会异常增多。这些中性粒细胞被激活后，会释放出一种叫做中性粒细胞胞外陷阱（NETs，它是由解聚的染色质和一些具有免疫刺激和杀菌特性的分子组成的大型细胞外结构 ）的物质。NETs 可不得了，它会让肺上皮细胞死亡，还在新冠相关的免疫血栓形成过程中起着关键作用，就像是一把 “双刃剑”，在对抗病毒的同时，也对身体造成了伤害。但是，科学家们还不清楚在新冠感染过程中，NETs 形成的具体机制是什么，这就像一团迷雾，笼罩在新冠研究的道路上。

为了拨开这团迷雾，广州医科大学附属第二医院的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Cell Communication and Signaling》期刊上，论文题目是 “COVID-19 patient serum-derived extracellular vesicles deliver miR-20b-5p induces neutrophil extracellular traps”。这项研究发现，新冠患者血清来源的细胞外囊泡（EVs，它是细胞分泌的一种纳米级小囊泡，里面装着蛋白质、脂质、核酸等各种 “货物”，就像细胞之间传递信息的 “小包裹” ）能够诱导 NETs 的形成，而且 miR-20b-5p（一种微小核糖核酸，它虽然个头小，却能在基因表达调控中发挥大作用 ）在这个过程中起到了关键的诱导作用。这一发现就像在黑暗中找到了一盏明灯，为新冠治疗的研究指明了新的方向，意味着 miR-20b-5p 有可能成为治疗新冠的潜在靶点。

研究人员在开展这项研究时，用到了几个关键技术方法。首先是超速离心法，他们通过多次不同转速的离心操作，像 “淘金” 一样，从血清样本中分离出纯净的 EVs。接着，利用透射电子显微镜（TEM）和纳米颗粒跟踪分析（NTA）技术来鉴定 EVs，TEM 就像一个超级放大镜，能让研究人员直接看到 EVs 的形态和大小，NTA 则可以精确地测量 EVs 的浓度和粒径分布。另外，他们还运用了免疫荧光分析和扫描电子显微镜（SEM）技术，用来观察 NETs 的形成情况，这些技术就像是研究人员的 “火眼金睛”，帮助他们清晰地捕捉到细胞内发生的细微变化。同时，通过小 RNA 测序和分析，研究人员能够找出 EVs 中不同的 miRNA，并探究它们的作用。

下面我们来详细看看研究人员都有哪些重要发现。

新冠患者血清来源的 EVs 特征及中性粒细胞对其的摄取

研究人员先对新冠患者和健康志愿者血清来源的 EVs 进行了分析。NTA 结果显示，健康志愿者的 Normal-EVs 大小约为 97nm，而新冠患者的 COVID-19-EVs 略小，约为 90nm，而且新冠患者体内循环的 EVs 数量明显比健康人多。TEM 观察发现，这些分离出来的纳米颗粒呈现出典型的 30 - 200nm 大小，还有独特的杯状形态，这就确定了它们就是 EVs。

中性粒细胞作为免疫系统的 “先遣部队”，在新冠感染时会迅速响应。研究人员想知道，这些中性粒细胞能不能 “吃掉” 新冠患者的 EVs 呢？于是他们进行了实验，给 EVs 标记上荧光染料 PKH26，然后和中性粒细胞一起培养。通过激光扫描共聚焦显微镜观察发现，中性粒细胞真的能够摄取 COVID-19-EVs，这就像是细胞之间的一场 “秘密交易”，EVs 进入了中性粒细胞的 “领地”。

EVs 诱导 NETs 的形成

NETs 在新冠的免疫血栓形成中扮演着重要角色，那 COVID-19-EVs 对 NETs 有什么影响呢？研究人员用新冠患者的 EVs 处理从健康人血液中分离出来的中性粒细胞，再用免疫荧光染色技术观察。他们发现，用 COVID-19-EVs 处理的中性粒细胞中，出现了纤维状的细胞外 DNA，并且和 H3cit（NETs 的一个标志性分子 ）共定位，而 Normal-EVs 处理的细胞中就没有这种现象。这就表明，COVID-19-EVs 能够诱导 NETs 的形成。

为了进一步验证，研究人员还把 PMA（一种能诱导 NETs 形成的物质 ）作为阳性对照。结果发现，COVID-19-EVs 不仅能自己诱导 NETs 形成，还能增强 PMA 诱导的 NETs 形成。另外，研究人员比较了 EB-EVs、Influenza A-EVs 和 COVID-19-EVs 对 NETs 形成的影响，发现虽然这三种 EVs 都能诱导 NETs 形成，但 COVID-19-EVs 的效果明显更强。通过扫描电子显微镜观察，也能清楚地看到 COVID-19-EVs 处理的中性粒细胞周围有大量的 NETs 形成。而且，即使去掉血清中的 EVs（即 COVID-19-EVs-Free），仍然能诱导 NETs 形成，只不过效果比 COVID-19-EVs 弱一些，这说明血清中除了 EVs，可能还有其他物质也能诱导 NETs 形成，但 EVs 在这个过程中起着重要作用。

COVID-19-EVs 来源的 miRNA 特征

EVs 里面的 “货物” 种类繁多，其中 miRNA 在调节基因表达方面起着关键作用。研究人员想知道，到底是哪些成分让 COVID-19-EVs 能够诱导 NETs 形成呢？于是他们对 COVID-19-EVs 和 Normal-EVs 中的 miRNA 表达谱进行了分析。这一分析发现，有 78 种 miRNA 存在显著差异表达，其中 27 种表达上调，51 种表达下调。

通过 GO 分析，研究人员发现这些差异表达的 miRNA 和很多细胞过程、细胞器都有关系，比如树突膜、AMPA 谷氨酸受体复合物，还参与了对血小板衍生生长因子的反应、Fc 受体介导的刺激信号通路以及白细胞介素 - 1 介导的信号通路等。KEGG 分析则表明，这些 miRNA 主要和 MAPK、cAMP 信号通路相关。之前的研究就发现，激活 MAPK 信号通路能促进 NETs 形成，而前列腺素 E2（PGE2）通过 cAMP 和蛋白激酶 A 依赖的方式可以抑制中性粒细胞形成 NETs。这就进一步说明了这些差异表达的 miRNA 可能参与了 NETs 的形成过程。

新冠患者血清来源的高丰度 EVs 携带与 NETs 形成相关的特定 miRNA

研究人员通过比较 COVID-19-EVs 和 Normal-EVs 中 miRNA 的表达情况，筛选出了 8 种在 COVID-19-EVs 中高表达的 miRNA，分别是 9_37654、2_18444、11_5823、18_16034、11_5766、miR-20b-5p、1_1765、miR-4271。他们用免疫荧光和扫描电子显微镜研究这些 miRNA 在 NETs 形成中的作用，结果发现这 8 种 miRNA 都能诱导 NETs 形成。其中，miR-20b-5p 的诱导作用最为显著，它不仅能自己诱导 NETs 形成，还能明显促进 PMA 诱导的 NETs 形成，就像一个 “强力助推器”，在 NETs 形成过程中发挥着重要作用。

抑制 miR-20b-5p 可显著下调 COVID-19-EVs 介导的 NETs 形成

为了进一步确定 miR-20b-5p 在 COVID-19-EVs 诱导 NETs 形成过程中的作用，研究人员用 miR-20b-5p 抑制剂处理中性粒细胞，降低 COVID-19-EVs 中 miR-20b-5p 的水平。结果发现，抑制 miR-20b-5p 后，COVID-19-EVs 介导的 NETs 形成明显减少，而且对 PMA 诱导的 NETs 形成的促进作用也大大降低。这就像是给 miR-20b-5p 这个 “小能手” 戴上了 “枷锁”，让它没办法再 “大展身手”，从而证明了 miR-20b-5p 在 COVID-19-EVs 诱导 NETs 形成中确实起着至关重要的作用。

综合这些研究结果，研究人员得出结论：新冠患者血清来源的 EVs 会被中性粒细胞摄取，进而诱导 NETs 形成，这一过程和免疫血栓形成密切相关，会加重新冠患者的病情。在这个过程中，研究人员发现了 8 种和 NETs 形成有关的 miRNA，其中 miR-20b-5p 的诱导作用最强。抑制 miR-20b-5p 后，COVID-19-EVs 诱导的 NETs 形成显著减少，这就表明 miR-20b-5p 有可能成为治疗新冠的潜在靶点。

在讨论部分，研究人员提到，之前有研究发现新冠患者血清中血小板和粒细胞来源的 EVs 水平会升高，而且 EVs 中的 miRNA 可能和新冠患者的血栓并发症有关，但具体机制还不清楚。这次研究发现新冠患者血清来源的 EVs 能诱导 NETs 形成，这就揭示了一个新的机制，这个机制会形成一个自我放大的反馈回路，让新冠患者体内的炎症反应和免疫血栓形成越来越严重。

这项研究意义重大，它让我们对新冠患者体内过度炎症反应和免疫血栓形成的分子机制有了更深入的了解。找到了 miR-20b-5p 这个潜在治疗靶点，就像是找到了一把打开新冠治疗新大门的钥匙，为开发新的治疗策略提供了重要依据，也让我们在对抗新冠这场战斗中看到了新的希望。未来，科学家们可以基于这个发现，进一步研究如何精准地调控 miR-20b-5p 的功能，说不定就能研发出更有效的治疗方法，帮助更多的新冠患者恢复健康。