在微观的生命科学世界里，科学家们一直渴望窥探生物分子结构的奥秘，而冷冻电镜（CryoEM）技术就像是一把神奇的钥匙，为他们打开了这扇神秘的大门。随着硬件和软件的不断升级，冷冻电镜变得越来越强大，它能让科学家们清晰地看到生物分子在接近天然状态下的模样，从单个蛋白质到细胞组织，都能细致入微地展现出来。

不过，这把 “钥匙” 虽然厉害，却也存在不少问题。首先，冷冻电镜的成本高得惊人，购买设备、维护仪器、使用过程中的消耗，每一项都需要大量资金投入。而且，具备冷冻电镜功能的透射电子显微镜（TEM）数量有限，很多科研人员都要排队等待使用，这大大拖慢了研究的进度。想象一下，科学家们满怀期待地想要深入研究生物分子结构，却因为设备的限制而不得不停滞不前，这是多么无奈的事情。所以，如何在有限的资源下，提高冷冻电镜数据收集的效率、降低成本，就成了科研领域亟待解决的重要问题。

为了攻克这个难题，来自美国明尼苏达大学荷美尔研究所（The Hormel Institute, University of Minnesota）的研究人员 Janarjan Bhandari、Dmytro Kompaniiets、Ajit Kumar Singh 等人展开了深入研究。他们的研究成果发表在了《BMC Methods》期刊上，论文题目是 “Efficient strategies and troubleshooting for single particle cryoEM data collection using EPU” 。经过一系列严谨的实验和分析，他们得出了不少重要结论，这些结论就像是为冷冻电镜研究领域点亮的一盏明灯，为后续研究指明了方向。他们发现，使用 Faster 采集模式、计数超分辨率、2 倍采样（Binning 2）以及非增益归一化 TIFF 输出文件格式，能够显著提高数据收集效率，同时在分辨率上也能达到较为理想的效果，这对于优化冷冻电镜数据收集策略有着重要意义。

在这项研究中，研究人员用到了几个关键技术方法。他们利用 Thermo Fisher 的 EPU 软件进行自动化冷冻电镜数据收集，通过设置不同的采集模式和参数来收集数据。在数据处理阶段，使用 cryoSPARC v4.5.3 软件对冷冻电镜数据进行处理，包括对剂量分帧电影进行 Patch 运动校正和 Patch CTF 估计，还运用自动 Blob 选择器进行初始粒子挑选，之后进行多轮 2D 分类和 3D 重建等操作。

下面来详细看看他们的研究结果。

研究人员选择了铁蛋白（Apoferritin）作为实验样本，这可是冷冻电镜数据收集策略优化中的 “明星分子”。它结构稳定、具有对称性，而且已经被研究得比较透彻，就像一把精准的 “标尺”，用它来测试不同的数据收集策略再合适不过了。研究人员从 Thermo Scientific 公司购买了铁蛋白，保证了实验样本的一致性，这样不同策略下得出的结果就更有可比性。他们在实验中保持了一些关键参数的一致，比如放大倍数（130,000x）、散焦范围（?2.5 μm 到 ?0.75 μm）和每部电影的帧数（40）。而不同数据集之间的差异主要体现在三个方面：采集模式（计数模式与计数超分辨率模式）、数据收集方法（精确的 “通过样品台移动进行机械定心” 与更快的 “通过图像 / 电子束移动进行光学定心”）以及电影文件格式（MRC 与 TIFF）。

研究人员收集了六个数据集，每个数据集包含的电影数量大致相似，在 1,354 到 1,546 之间。但是，Faster 模式和 Accurate 模式的数据收集速率却相差甚远。Faster 模式下，计数超分辨率模式、2 倍采样且光学定心时，每小时能收集 736 - 758 部电影；而 Accurate 模式下，同样是计数超分辨率模式、2 倍采样，机械定心时，每小时只能收集 134 - 160 部电影，这速度差距就像跑车和自行车，一下子就拉开了。

再看看文件格式，TIFF 格式的电影文件每文件大约占用 166MB 空间，而 MRC 格式的文件平均要占用 920MB，MRC 格式简直就是 “空间大胃王”。在分辨率方面，以 TIFF 格式、计数超分辨率精确模式、2 倍采样收集的数据（实验 1）得到的冷冻电镜图分辨率最高，达到 2.19? 。不过，虽然 Faster 模式的数据收集速度快，但分辨率相对较低，比如同样是 TIFF 格式、计数超分辨率、2 倍采样的实验 2，分辨率只有 2.80? 。MRC 格式的数据也呈现出类似的趋势。

后来，研究人员发现结果存在差异，于是重新处理数据，这次他们加入了包含电子束移动信息的.XML 文件，这就像是给数据处理加上了一个 “校准器”。校正后，Accurate 模式的分辨率提升不明显，但 Faster 模式下重建模型的分辨率有了显著提高。这表明 Faster 模式在保证采集速度的同时，也能通过后期处理提升数据质量，潜力巨大。

研究人员还讨论了在冷冻电镜研究中的一些重要发现。在数据采集速度方面，Faster 模式利用 Aberration Free Image Shift（AFIS）软件，不用频繁移动样品台就能对多个区域成像，大大提高了采集速度。虽然在某些情况下，图像 / 电子束移动可能会影响图像质量，但现在通过 AFIS 校准和数据处理阶段的校正，这个问题得到了有效解决。相比之下，Accurate 模式由于频繁移动样品台，还需要进行放大倍数和透镜归一化调整，采集速度比 Faster 模式慢很多，最多能相差五倍。如果样品存在择优取向问题，或者需要结合在线数据处理方法，Faster 模式的高速采集优势就能充分发挥出来，而且在共享设备的情况下，能让更多研究人员使用设备。

文件格式方面，TIFF 和 MRC 格式存储的信息质量相近，但 TIFF 格式占用空间小，大约只有 MRC 格式的五分之一，在存储管理上方便很多。虽然不同文件格式可能会影响与数据处理软件的兼容性，但必要时可以将 TIFF 转换为 MRC 格式。在数据处理结果中，两种格式得到的模型质量几乎相同，分辨率差异可以忽略不计，所以从存储空间考虑，TIFF 格式更具优势。

采样（Binning）对数据收集速度和文件大小都有影响。K3 相机默认以超分辨率模式采集图像，不同的采样方式会导致数据处理过程有所不同。2 倍采样能增强生物样品的对比度，但会降低最终图像的分辨率。不过在实验中，计数超分辨率模式下 2 倍采样和 1 倍采样得到的最终图谱质量相似，只是计数 1 倍采样的分辨率略低。对于生物样品来说，硬件提供的最大物理分辨率往往难以达到，所以需要在采样、数据采集速度和预期图像质量之间做出权衡。

计数超分辨率模式和计数模式理论上在最大可实现分辨率上有两倍的差异，但实验发现，在 1 倍采样、Faster 采集模式且输出为非增益归一化 TIFF 格式的情况下，两种模式的数据收集速度相似，得到的冷冻电镜图分辨率也相近。这可能是因为样品性能优秀，加上实验中采用的对称性处理，掩盖了两者之间的差异。

基于这些研究结果，研究人员给出了实验设计的建议。如果是进行样本筛选，主要目的是评估样本的初始质量和性质，可以使用中等范围的设备，如 100 kV 或 200 kV 的显微镜（像 Tundra、Glacios 或 Arctica），收集大约一百部电影，根据粒子密度和样本浓度调整数量，同时选择合适的放大倍数和像素大小。

初始（试验）数据收集则可以在中等范围和高端显微镜上进行，根据筛选结果收集多达一千张图像。对于某些不需要高分辨率的研究，比如研究大分子复合物的组装或整体结构，这种方式能节省成本和时间。

大型（最终）数据收集通常使用高端的 300 kV 显微镜，如 Titan Krios，数据集大小一般在 2,000 到 8,000 部电影之间，可根据样本需求和期望分辨率进行调整。对于已知结构的蛋白质或样本，想要提高分辨率观察特定结构时，这一步很关键；对于新的或未表征的目标，以及动态、灵活的蛋白质或不稳定的结合伙伴，可能需要收集更大的数据集，便于在数据处理时进行粒子分类，研究分子间的动态相互作用。

这项研究的结论和讨论意义重大。它为冷冻电镜数据收集提供了一套切实可行的优化策略，建议使用 Faster 采集模式、计数超分辨率、2 倍采样以及非增益归一化 TIFF 输出文件格式，同时在数据处理时导入.XML 文件并进行光学分组，能有效提高效率和数据质量。研究还强调，科研人员要明确实验目的，根据需求选择合适的分辨率，避免盲目追求高分辨率带来的成本增加。此外，样品的优化也至关重要，它能避免实验延误，提高显微镜的使用效率。未来，冷冻电镜数据收集策略还有很大的提升空间，需要研究更多不同类型的样本，不断调整处理流程，以适应各种复杂的实验情况。总之，这项研究为冷冻电镜领域的发展提供了重要的参考，让科研人员在探索生物分子结构的道路上走得更稳、更快。