在动物繁殖领域，精子冷冻保存技术可是个 “大明星”，它就像一个神奇的 “时间胶囊”，能把精子保存起来，为人工授精和物种繁衍立下汗马功劳。但这个 “时间胶囊” 目前还不太完美，在精子冷冻过程中，有 40% - 50% 的精子都 “扛不住”，即便存活下来的，生理功能也常常 “大打折扣”，这就是让人头疼的精子冷冻损伤问题。

这背后的 “罪魁祸首” 之一就是氧化应激。正常情况下，精子里的活性氧（ROS）在适量时，能帮助精子维持正常生理功能，比如保证染色质稳定、保护 DNA、促进精子获能和向前运动。可一旦 ROS 过量，就会引发氧化应激，它会像个 “破坏分子” 一样，对精子细胞膜进行脂质过氧化，还会损伤线粒体，最后伤害到精子的 DNA，导致精子死亡。

一直以来，大家都知道氧化应激能诱导细胞凋亡（一种细胞程序性死亡），而且在精子冷冻保存过程中，也观察到了凋亡相关标记物的变化。但奇怪的是，给精子加上凋亡抑制剂，对精子的存活和细胞膜完整性并没有明显改善。这就让科学家们犯嘀咕了：难道除了凋亡，还有其他形式的细胞程序性死亡（RCD）在精子冷冻损伤中起作用？

于是，内蒙古农业大学动物科学学院绵羊与山羊遗传育种与繁殖内蒙古自治区重点实验室的研究人员，决心要揭开这个谜团。他们在《Journal of Animal Science and Biotechnology》期刊上发表了一篇名为 “Ferroptosis emerges as the predominant form of regulated cell death in goat sperm cryopreservation” 的论文。经过一系列研究，他们发现铁死亡（ferroptosis）才是山羊精子冷冻保存过程中主要的细胞程序性死亡形式，这一发现就像在黑暗中找到了一盏明灯，为后续优化冷冻保存方案、提高精子冻融后的活力指明了方向。

为了完成这项研究，研究人员使用了多个关键技术方法。他们运用非靶向代谢组学分析，来找出新鲜和冻融山羊精子样本之间的差异代谢物，就像拿着一个 “放大镜”，仔细观察精子在冷冻前后的化学变化。还添加了铁死亡和凋亡抑制剂，观察它们对精子冷冻损伤的影响，以此判断不同细胞死亡形式在冷冻损伤中的作用。另外，利用流式细胞术评估精子的多种参数，比如细胞程序性死亡水平、ROS 水平、脂质过氧化程度、浓度，以及细胞膜和顶体的完整性，全面地了解精子的 “健康状况”。

下面来看看具体的研究结果。

研究人员对新鲜和冻融的精子样本进行非靶向代谢组学分析，这一分析就像给精子做了一次 “全身检查”，发现了 637 种次生代谢物，其中脂质和类脂分子占比最大。通过进一步分析，他们找到了 162 种差异表达的代谢物，冻融组的多种溶血磷脂（Lyso - PLs）显著增加，而这一变化暗示着铁死亡可能参与了精子冷冻损伤过程。

研究人员在冷冻前给精子稀释液里加入不同浓度的铁死亡抑制剂（Lip - 1、Fer - 1、DFO）和凋亡抑制剂（Z - VAD），结果发现，像 2 μmol/L DFO、2 μmol/L Fer - 1 和 5 μmol/L Lip - 1 这些铁死亡抑制剂，能显著提高精子的总活力（TM），相比之下，凋亡抑制剂 Z - VAD 虽然也有一定效果，但并不显著。这表明铁死亡和凋亡都与精子冷冻损伤相关，不过铁死亡可能起着更关键的作用。

在研究精子冷冻损伤时，精子质膜和顶体的完整性很重要。研究发现，所有细胞程序性死亡抑制剂处理组的精子质膜完整率都比对照组高，而且铁死亡抑制剂组的效果比凋亡抑制剂组更好。在顶体完整性方面，铁死亡抑制剂组的完整率显著高于对照组和凋亡抑制剂组，凋亡抑制剂组和对照组之间则没有明显差异。同时，铁死亡抑制剂组细胞程序性死亡的比例明显低于对照组和凋亡抑制剂组。这些结果都说明铁死亡抑制剂在保护精子质膜和顶体完整性、减少细胞程序性死亡方面有重要作用。

ROS 水平与精子冷冻损伤密切相关，铁死亡抑制剂和凋亡抑制剂都能降低细胞内 ROS 水平，但铁死亡抑制剂组降低得更明显。在脂质过氧化方面，铁死亡抑制剂组的水平显著低于对照组和凋亡抑制剂组，凋亡抑制剂组和对照组之间没有显著差异。水平也是一样，铁死亡抑制剂组显著低于对照组和凋亡抑制剂组。这进一步证明了铁死亡抑制剂能有效减轻精子冷冻损伤。

研究人员通过流式细胞术检测关键蛋白的表达水平，发现新鲜精子活细胞群体中，转铁蛋白受体蛋白 1（TFRC）的阳性率为 47.8% ，冻融精子活细胞群体中为 71.5% ，而死细胞群体中高达 82.5% ，呈现逐渐升高的趋势。相反，裂解的半胱天冬酶 - 3（CL - caspase3）在新鲜精子和冻融精子活细胞群体中的阳性率没有显著差异，但在死细胞群体中明显升高。谷胱甘肽过氧化物酶 4（GPX4）在新鲜精子活细胞群体中的阳性率高达 92.9% ，在冻融精子活细胞群体中降至 54.5% ，在死细胞群体中又升高到 87.8% 。铁蛋白重链（FTH1）在新鲜精子活细胞群体中的阳性率为 94.8% ，在冻融精子活细胞群体中为 60.4% ，在死细胞群体中仅为 11.9% 。这些蛋白表达水平的变化趋势表明，铁死亡是精子冷冻损伤中主要的细胞程序性死亡形式。

综合研究结果和讨论部分，这项研究意义重大。以往人们对精子冷冻损伤机制的认识不够深入，不知道除了凋亡还有什么因素在起关键作用。而这次研究明确了铁死亡才是山羊精子冷冻保存过程中主要的细胞程序性死亡形式，这是一个全新的发现。

研究还发现一些铁死亡抑制剂，像 Lip - 1 和 Fer - 1，能显著减轻精子冷冻损伤，这就给优化精子冷冻保存方案提供了新的思路。以前遇到精子冷冻损伤问题，大家都不知道该从哪里入手，现在有了这些铁死亡抑制剂，就像找到了新的 “武器”，有可能提高精子冻融后的活力，让更多精子在冷冻保存后还能保持良好的 “战斗力”，为动物繁殖和人工授精技术的发展带来了新的希望。虽然目前在实际应用中还面临一些挑战，比如还不知道这些抑制剂对受精率和整体生殖结果有什么影响，但这项研究无疑为后续研究奠定了坚实的基础，让人们朝着解决精子冷冻损伤问题又迈进了一大步。