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为解决 VTIs 在血栓形成中的作用及抗血栓抑制剂开发问题，福州大学等单位研究人员开展相关研究。结果揭示 VTIs 结构、功能及相关抑制剂效果。该研究为抗血栓治疗提供新思路，强烈推荐科研读者阅读。
在人体的血管世界里，血栓的形成就像一场悄然而至的 “风暴”，时刻威胁着人们的健康。当血管受伤时，血小板会迅速聚集形成血栓，这本是身体的一种自我保护机制，但如果血栓形成过多或在不该形成的地方形成，就可能导致血管堵塞，引发严重的心血管疾病。在这场 “风暴” 背后，有一群神秘的 “幕后推手”—— 血管硫醇异构酶（Vascular Thiol Isomerases，VTIs），它们在血栓形成过程中发挥着至关重要的作用。然而，科学家们对 VTIs 的了解还十分有限，比如它们的具体结构是怎样的？在血栓形成中到底有着怎样的功能？能不能开发出针对它们的抗血栓药物呢？这些问题就像一团团迷雾，笼罩在血管生物学研究的前沿领域，亟待科学家们去揭开谜底。
为了探索这些问题的答案，福州大学的研究人员与哈佛大学医学院的学者携手合作，在《Thrombosis Journal》期刊上发表了一篇名为 “Recent advances in vascular thiol isomerases: insights into structures, functions in thrombosis and antithrombotic inhibitor development” 的论文。这篇论文就像一把钥匙，为我们打开了了解 VTIs 的大门，它详细阐述了 VTIs 的结构、在血栓形成中的功能，以及针对 VTIs 开发抗血栓抑制剂的研究进展，对心血管疾病的防治有着重要意义。
研究人员在探索 VTIs 的过程中，运用了多种技术方法。他们利用定点突变技术，就像是给蛋白质的特定部位进行 “微调”，通过改变 VTIs 中某些氨基酸的结构，来研究这些变化对其功能的影响。小角 X 射线散射（Small-angle X-ray Scattering，SAXS）技术则像一个神奇的 “放大镜”，帮助研究人员观察 VTIs 的整体结构，了解它们在溶液中的形态。此外，分子动力学模拟就像给分子世界拍了一部 “动态电影”，让研究人员能够从微观层面分析 VTIs 与抑制剂之间的相互作用，为理解它们的功能和开发抑制剂提供了有力支持。
下面我们来深入了解一下研究的具体结果。
一、VTIs 的结构和功能
VTIs 家族成员众多，包括蛋白质二硫键异构酶（Protein Disulfide Isomerase，PDI）、内质网蛋白 5（Endoplasmic Reticulum Protein 5，ERp5）、ERp46、ERp57、ERp72、硫氧还蛋白相关跨膜蛋白 1（Thioredoxin-related Transmembrane Protein 1，TMX1）和 TMX4 等。这些成员就像一个个分工明确的 “小工匠”，各自有着独特的结构和功能。
- PDI：PDI 是 VTIs 家族中最早被发现的 “明星成员”。它拥有四个硫氧还蛋白样结构域，就像四个紧密合作的 “小车间”，呈 U 形排列。其中，a 和 a’结构域是催化 “小车间”，负责形成、断裂和重新排列二硫键，它们的 CGHC 基序就像一把把精准的 “小剪刀”，能够对二硫键进行操作。b 和 b’结构域则像是 “连接器” 和 “底物招募员”，b’结构域的疏水口袋能与底物结合，而 19 个氨基酸的连接子（X - linker）就像一根 “弹性绳子”，连接着 b’和 a’结构域，影响着底物的结合。此外，PDI 的 C 末端有许多带负电的氨基酸，这些氨基酸就像一个个 “小磁铁”，在 PDI 的伴侣功能中发挥着重要作用。
- ERp57：ERp57 和 PDI 有些相似，也有四个硫氧还蛋白样结构域，同样形成 U 形结构。不过，它的 b’结构域口袋带正电，这使得它能与带负电的底物，如凝集素伴侣钙网蛋白（Calnexin，CNX）/ 钙连蛋白（Calreticulin，CRT）的臂状 P 结构域相互作用，帮助新合成的糖蛋白正确折叠和进行质量控制。在肽装载复合物（Peptide-loading Complex，PLC）的形成过程中，ERp57 也扮演着重要角色，它与 CRT 和 Tapasin 相互作用，稳定 PLC，控制肽的装载。
- ERp72：ERp72 是 VTIs 家族中的 “独特成员”，它有五个硫氧还蛋白样结构域，呈新月形。通过定点突变研究发现，N 末端的 a?结构域主要参与催化，a 结构域在催化和结合中都有作用，a’结构域则主要负责结合底物。ERp72 的 b’结构域有一个带负电的区域，虽然它不像 PDI 和 ERp57 那样能结合特定的底物，但它的 a?a 片段有疏水区域，能与蛋白质底物结合。而且，ERp72 的 N 末端有很多带负电的氨基酸，是 Ca2?的结合位点，能介导它与其他伴侣蛋白的相互作用。
- ERp46：ERp46 属于 PDI 家族，但它的分子结构与其他成员大不相同。它有三个表面暴露的 CGHC 基序，分别位于 a?、a 和 a * 结构域，这些活性位点能独立发挥作用。与其他 PDI 成员相比，它能快速地将二硫键引入未折叠的底物中，随后 PDI 再进行更精确的二硫键形成。虽然 ERp46 在血小板表面的表达会随着凝血酶的刺激而增加，但它在血栓形成中的具体作用还不太清楚。
- ERp5：ERp5 含有两个催化结构域（a?和 a’）和一个非催化 b 结构域，呈独特的 a? - a2 - b 排列。虽然它的整体结构还未确定，但研究人员推测它可能像 ERp46 一样，形成开放和延伸的构象，方便与底物结合，在氧化蛋白质折叠的早期阶段促进二硫键的引入。
- TMX1：TMX1 是 VTIs 家族中的跨膜成员，就像一个 “跨膜小卫士”。它有一个大的 N 末端区域，含有一个 TRX 样结构域，还有一个短的胞质尾巴，胞质尾巴上有棕榈酰化和磷酸化位点。它的活性位点是非经典的 CPAC，而且没有 b 或 b’结构域和典型的内质网保留序列，但它胞质尾巴上的双精氨酸（RQR）基序能帮助它留在内质网中。TMX1 对维持血小板的静止状态很重要，它能对抗 ERp46 的作用，防止血小板过度激活，还能与维生素 K 环氧化物还原酶（Vitamin K Epoxide Reductase，VKOR）相互作用。
- TMX4：TMX4 是 TMX1 的 “近亲”，它是一种单跨膜 I 型糖蛋白。它有一个 N 末端的 TRX 样结构域，含有非经典的 CPSC 活性位点。研究发现，TMX4 能与 CNX 和 ERp57 相互作用，在蛋白质折叠过程中，它可以直接修饰底物，促进其氧化成熟，也可以通过还原 ERp57 的催化位点，间接促进其作为糖蛋白特异性氧化酶的功能。
二、VTIs 与血栓形成中的底物
VTIs 主要存在于巨核细胞的内质网和血小板的致密管状系统中，在内皮细胞中则位于与魏尔 - 帕拉德体不同的囊泡中。当血小板或内皮细胞被激活时，VTIs 就会被释放到细胞表面和循环系统中，就像一群被释放的 “小信使”，它们会调节血管细胞受体、黏附蛋白和凝血因子的活性，影响血栓的形成。
- 血小板表面受体：整合素 αIIbβ3 是血小板表面最丰富的受体，它就像一个 “信号接收器”。在静息血小板中，它呈弯曲构象，不与配体结合。当血小板被激活时，它会发生构象变化，变得伸展，从而能够识别纤维蛋白原、血管性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF）和纤连蛋白上的特定肽段，促进血小板的黏附、聚集和血栓形成。多种 VTIs，如 ERp5、PDI、ERp57、ERp72、ERp46、TMX1 和 TMX4，都能影响 αIIbβ3 的功能。例如，ERp5 能以力介导的方式切割 αIIbβ3 的 βI 结构域上纤维蛋白原结合口袋边缘的二硫键，调节纤维蛋白原的释放，影响血小板的黏附。而 PDI、ERp57 和 ERp72 可能通过还原或异构化 αIIbβ3 的二硫键，改变其构象，增强血小板与纤维蛋白原的连接，促进血栓形成。TMX1 则可以氧化 αIIbβ3 的二硫键，抑制其激活，从而抑制血小板聚集和血栓形成。
- 基质蛋白：血栓形成过程中，细胞外基质中的黏附蛋白起着重要作用。血栓反应蛋白 - 1（Thrombospondin - 1，TSP - 1）是一种多结构域糖蛋白，PDI 可以调节 TSP - 1 的 Cys974，使其隐藏的 RGD 基序暴露，增强整合素的结合，影响其细胞黏附特性。玻连蛋白（Vitronectin）能与多种蛋白质结合，参与血栓形成，PDI 可以还原玻连蛋白的二硫键，使其能够与 αIIbβ3 和 αvβ3 结合。vWF 是一种大的糖蛋白多聚体，在高剪切力下能捕获血小板，虽然目前还不清楚 VTIs 是否像调节 αIIbβ3 那样以力介导的方式调节 vWF 的功能，但 PDI 已被报道能调节 vWF 在 ER 中的二聚化。
- 凝血因子：PDI 还直接参与调节凝血因子的激活，如因子 XI（Factor XI，FXI）、因子 V（Factor V，FV）和组织因子（Tissue Factor，TF）。PDI 可以切割 FXI 的二硫键，使其更容易被激活。对于 FV，PDI 可以还原其在血栓形成初期的二硫键，调节其活性，还能通过切割与多聚蛋白的二硫键，释放 FV，促进凝血酶的生成。TF 是启动血液凝固的关键因子，虽然 PDI 在 TF 激活中的作用存在争议，但有证据表明 PDI 参与了 TF 的解密过程，调节其活性。
三、VTIs 在血栓形成中的工作模型
VTIs 在血栓形成中各自发挥着独特的作用，它们之间的作用似乎并不重叠。研究发现，在缺乏 PDI、ERp57 或 ERp72 的血小板中，只有添加相应缺失的 VTI 才能恢复血小板聚集，添加其他类型的 VTI 则不行，这表明它们通过不同的机制调节血小板聚集。基于 VTIs 的氧化还原能力，它们可能通过两种方式催化反应：一种是一个 VTI 在 αIIbβ3 中产生硫醇，另一种 VTI 随后催化硫醇 - 二硫键交换反应；或者一个 VTI 作用于另一个 VTI，再由后者作用于 αIIbβ3。此外，有研究人员提出 VTIs 构成了一个氧化还原链，电子从最具还原性的硫氧还蛋白流向最具氧化性的 ERp57，ERp72、ERp5 和 PDI 依次参与这个过程，但 TMX1 如何参与这个氧化还原链还有待进一步探索。
四、针对 VTIs 的抗血栓抑制剂
由于 VTIs 在调节血栓相关蛋白的二硫键方面发挥着重要作用，开发针对 VTIs 的抗血栓药物成为了一个新的研究方向。近年来，通过高通量筛选技术，研究人员发现了许多针对 VTIs 的小分子抑制剂。
- 黄酮类化合物：槲皮素 - 3 - 芸香糖苷（Quercetin - 3 - rutinoside，又称芦丁，Rutin）是一种备受关注的抗血栓抑制剂。它在体内具有出色的抗血栓效果，且不易引起出血。研究发现，芦丁能直接与 PDI 结合，使 PDI 变成封闭构象，抑制其还原活性。不过，芦丁的水溶性和口服生物利用度较低，为此研究人员制备了芦丁 - 锌络合物和负载芦丁的脂质纳米制剂（NanoR），不仅提高了芦丁的水溶性，还增强了其抗血栓活性，且安全性良好。异槲皮苷（Isoquercetin）是芦丁的类似物，在癌症患者的抗血栓临床试验中表现出良好的效果，能有效降低血浆 PDI 活性、D - 二聚体水平、血小板依赖性凝血酶生成和可溶性 P - 选择素水平。杨梅素（Myricetin）也具有良好的抗血小板作用，它能通过非共价氢键与 PDI 的结构域结合，抑制其还原活性，还对 ERp5 有抑制作用。
- 其他小分子抑制剂：研究人员还发现了一些其他的小分子抑制剂，如 bepristats（bepristat 1a 和 bepristat 2a）和 ML359。这些抑制剂能抑制血小板聚集和血栓形成，它们通过与 PDI 的 b’结构域结合，影响 PDI 的活性。鞣酸（Tannic Acid，TA）是一种从植物中提取的没食子酸酯化多酚，能与 PDI 的活性位点紧密结合，抑制血小板和血栓的形成，且不引起出血。胡桃醌（Juglone）能抑制 PDI 的活性，有效抑制血小板聚集和糖蛋白（GP）IIb/IIIa 激活。迷迭香酸（Rosmarinic Acid）是一种水溶性酚类化合物，能特异性抑制 ERp57 的活性，通过与 ERp57 的 a’结构域结合，抑制花生四烯酸诱导的血小板聚集。
- 广谱抑制剂和肽类抑制剂：ADTM 和扎鲁司特（Zafirlukast）是 VTIs 的广谱抑制剂，能抑制 PDI、ERp5、ERp57 和 ERp72 的活性，有效抑制血小板聚集和血栓形成，且不影响止血。肽类抑制剂 CXXC 是一种源自 PDI C 末端部分序列的 12 氨基酸肽，它能与 PDI a’结构域的 Cys400 共价结合，不可逆地抑制 PDI 活性，进而抑制 αIIbβ3 的活性。
论文的研究结论表明，VTIs 在血栓形成和血小板功能中起着至关重要的作用。它们具有多样的结构和功能机制，不仅参与二硫键的形成和异构化，还作为伴侣蛋白稳定蛋白质复合物。针对 VTIs 的小分子抑制剂展现出了作为抗血栓药物的潜力，它们能有效抑制血小板聚集和血栓形成，且不延长出血时间。然而，由于 VTIs 结构域之间的高度同源性，开发特异性的 VTIs 抑制剂仍然面临挑战。
在讨论部分，研究人员指出，未来开发针对 VTIs 的抗血栓抑制剂需要考虑多个因素。抑制剂的可逆性很重要，不可逆的抑制剂虽然在抗肿瘤方面可能有效果，但在抗血栓治疗中可能会增加出血风险。细胞膜通透性也不容忽视，开发非细胞膜通透性的抑制剂可以避免影响细胞内的 VTIs，减少细胞毒性。此外，抑制剂的选择性和特异性至关重要，目前针对 VTIs 活性基序开发特异性抑制剂面临困难，而针对 b 和 b’结构域的抑制剂虽然有一定前景，但效力较低，其结合机制和对酶功能的影响也有待进一步研究。
这篇论文的研究成果为我们深入了解 VTIs 在血栓形成中的作用提供了重要依据，也为开发新型抗血栓药物开辟了新的方向。虽然目前还面临一些挑战，但随着研究的不断深入，相信未来能够开发出更有效、更安全的抗血栓药物，为心血管疾病的防治带来新的希望。
