在癌症的世界里，肝细胞癌（HCC）可是个 “狠角色”，它占了肝癌病例的 80% 以上，还是癌症相关死亡的第四大 “元凶”。目前，早期肝细胞癌还能通过手术切除来治疗，可大部分患者确诊时都已经到了晚期，手术这条路就行不通了。在药物治疗方面，传统的靶向药物，像索拉非尼和乐伐替尼，虽然能延长点患者的生存期，但效果还是有限。

这几年，免疫疗法成为了肝细胞癌治疗的焦点。免疫检查点抑制剂（ICIs）能激活人体自身的免疫系统来对抗癌细胞，听起来很厉害吧！美国国家综合癌症网络（NCCN）的指南也强调了它在一线治疗中的重要地位。可现实很残酷，患者对 ICIs 的反应并不好，总体缓解率只有 14 - 20%。这就好比给了患者一把对抗癌症的 “宝剑”，但很多人却用不好它。所以，弄清楚肝细胞癌的生物学特征，找到能预测 ICIs 疗效的生物标志物，就成了攻克肝细胞癌的关键。

以往的研究大多用批量 RNA 测序（bulk RNA - seq）来研究肿瘤治疗前后基因表达的变化，但这种方法就像给肿瘤拍了张 “大合照”，没办法看到细胞在肿瘤里的具体位置和分布情况。空间转录组（ST）技术就不一样啦，它能像 “显微镜” 一样，让研究人员看到免疫细胞在肿瘤里的分布和它们的分子特征，帮助大家更深入地了解肿瘤免疫微环境（TiME）。不过，现有的研究还没有搞清楚在 ICIs 治疗的情况下，免疫细胞的功能、空间分布，以及免疫治疗耐药的机制。

还有个关键的点，就是 G2/M 检查点。它在细胞周期里起着 “关卡” 的作用，能保证 DNA 复制的准确性，修复受损的 DNA。要是这个 “关卡” 出了问题，就容易导致癌症的发生和发展。在胰腺癌的研究中发现，G2M 检查点的基因集富集分析（GSEA）评分高，患者的生存期就短，对药物的敏感性也低。但它在肝细胞癌里扮演着什么角色，对 ICIs 的反应有什么影响，还需要更多的研究。

为了搞清楚这些问题，福建医科大学附属肿瘤医院等单位的研究人员在《Journal of Translational Medicine》期刊上发表了一篇名为 “G2M - checkpoint related immune barrier structure and signature for prognosis and immunotherapy response in hepatocellular carcinoma: insights from spatial transcriptome and machine learning” 的论文。他们通过研究，发现了一个和 G2M 检查点相关的免疫屏障结构，还开发出了一个能预测肝细胞癌预后和 ICIs 反应的特征模型，这对肝细胞癌的个性化治疗意义重大。

研究人员为了开展这项研究，用了不少厉害的技术方法。他们从多个数据库收集了基因表达谱和临床数据，像癌症基因组图谱（TCGA）、国际癌症基因组联盟（ICGC），还有基因表达综合数据库（GEO）。为了处理这些数据的批次效应，用了 “ComBat” 方法。在分析 ST 测序数据时，用了 “Seurat” R 包进行预处理，还通过主成分分析（PCA）来降维、聚类。另外，用了多种算法来分析通路活性、免疫浸润和免疫表型评分（IPS） ，还用了 167 种机器学习模型的组合来构建预后模型。

下面咱们来看看具体的研究结果。

研究人员分析了 6 位接受 ICIs 治疗的肝细胞癌患者的肿瘤组织 ST 数据（3 位有反应，3 位没反应）。经过质量控制，有 22438 个点适合进一步分析。用 “harmony” 算法整合样本、减少批次效应后，这些点被分成了 17 个不同的簇。通过基因集富集分析（GSEA）发现，在 ICIs 无反应组中，G2M 检查点是所有 HALLMARK 通路里上调最明显的。而且，在 ICIs 无反应患者中，M2 巨噬细胞形成了一种抑制性免疫屏障结构（SIBS），把恶性肝细胞包围起来，这个结构常出现在 G2M 检查点水平高的区域，而 ICIs 有反应的患者就没有这种情况。进一步分析还发现，ICIs 无反应组的抑制性免疫细胞更多，G2M 检查点水平更高，但阳性免疫细胞更少，免疫细胞浸润的比例也更低。这就好像在 ICIs 无反应患者的肿瘤里，有一道 “屏障”，把能对抗癌症的免疫细胞挡在了外面。

研究人员对 TCGA 的批量 RNA - seq 数据集进行 CIBERSORT 分析，评估免疫浸润情况。结果发现，G2M 检查点高表达组的抑制性免疫细胞（比如调节性 T 细胞，Tregs）明显增加，阳性免疫细胞（比如 M1 巨噬细胞和活化的自然杀伤细胞，NK 细胞）明显减少。用 “IOBR” 算法评估 IPS 评分后发现，在多个数据集里，G2M 检查点高表达组的 IPS 评分都比低表达组低。生存分析也表明，G2M 检查点高表达组的总生存期（OS）明显更差。这说明 G2M 检查点水平升高会促进抑制性 TiME 的形成，让患者对 ICIs 没反应，生存期也更短。

研究人员从 TCGA 训练队列里提取了 190 个 G2M 检查点基因，又加入了 116 个癌组织和正常组织的差异表达基因，以及 151 个和肝细胞癌患者 OS 相关的基因，最终确定了 106 个 G2M 检查点相关基因（G2MRGs）用于建模。他们用 10 种机器学习算法的 167 种组合，构建了肝细胞癌的预后预测模型，并在 3 个外部队列和 1 个内部队列中进行验证。最后发现，随机生存森林（RSF）和最小绝对收缩和选择算子（LASSO）算法的组合效果最好，这个模型叫 G2M 检查点相关特征（G2MRS），由 KPNA2、CENPA 和 UCK2 这 3 个基因组成。把患者按 G2MRS 中位数分成高低两组后，发现 G2MRS 高表达组的预后明显更差。和其他 73 个已发表的肝细胞癌预后模型相比，G2MRS 的一致性指数（C - index）更高，预测更稳定。而且，G2MRS 高表达也会促进抑制性 TiME 的形成，导致对 ICIs 无反应。

研究人员用福建医科大学孟超肝胆医院（MCHH）收集的 90 例肝细胞癌患者的样本，通过实时定量聚合酶链反应（RT - qPCR）来验证 G2MRS 的可靠性。除了 CENPA，KPNA2、UCK2 和 G2MRS 在癌组织里都明显上调。诊断性受试者工作特征曲线（ROC）显示，它们能区分癌组织和正常组织。生存分析发现，KPNA2 高表达组和 G2MRS 高表达组的 OS 明显更短。单因素和多因素 Cox 回归分析表明，G2MRS 和 KPNA2 是 OS 的独立危险因素。这说明 G2MRS 在内部队列里，既能作为诊断肝细胞癌的标志物，又能预测预后，KPNA2 也很有研究价值。

在 4 个批量 RNA - seq 队列里，除了 GSE116174 数据集，KPNA2 高表达组的 OS 都比低表达组差。而且，KPNA2 高表达组的 IPS 评分更低，对 ICIs 的反应更差。免疫浸润分析发现，KPNA2 高表达组的阳性免疫细胞减少，抑制性免疫细胞增加。这表明 KPNA2 在调节 G2M 检查点动态变化和 ICIs 反应中可能起着关键作用。

ST 分析显示，ICIs 无反应组的 KPNA2 表达明显比有反应组高。相关性分析发现，KPNA2 表达和 G2M 检查点水平密切相关。在 ICIs 无反应患者中，G2M 检查点水平高的区域，KPNA2 表达也高，而且这些区域被 SIBS 包围，而 ICIs 有反应患者没有这种现象。在 ICIs 无反应患者中，KPNA2 高表达组的抑制性免疫细胞比例更高，阳性免疫细胞比例更低。这进一步说明 KPNA2 和 G2M 检查点关系密切，可能是影响 SIBS 形成，导致 ICIs 无反应的关键基因。

为了研究 KPNA2 在肝细胞癌里的作用，研究人员构建了 KPNA2 敲低（KPNA2 - KD）和过表达（KPNA2 - OE）的细胞系。在 Huh - 7 和 SNU - 449 细胞系里，和对照组相比，KPNA2 敲低会降低细胞的迁移能力，减少细胞增殖，增加细胞凋亡；而 KPNA2 过表达则会起到相反的作用。这就表明，KPNA2 对肝细胞癌细胞的迁移、增殖、存活和凋亡都有重要影响。

总的来说，这项研究首次探究了 G2M 检查点和 ICIs 反应之间的空间关系，发现了由 M2 巨噬细胞组成的独特空间结构 SIBS。研究人员用 RSF 和 LASSO 算法开发了 G2MRS，只用 3 个基因就能比现有的评分更准确地预测肝细胞癌患者的生存和 ICIs 反应。通过各种验证队列和 ST 数据，确定了 KPNA2 是 G2M 检查点的关键基因，体外实验也证实了它在肝细胞癌细胞的迁移、增殖等过程中的重要作用。这些研究结果为克服 ICIs 耐药、改善肝细胞癌患者的预后指明了方向，让我们在攻克肝细胞癌的道路上又前进了一大步，为未来的个性化治疗带来了新的希望。不过，研究也有一些局限，比如是回顾性队列研究，还需要大规模、多中心的前瞻性临床试验来进一步验证 G2MRS 的有效性，而且 G2M 检查点和 KPNA2 影响 SIBS 形成和 ICIs 无反应的机制，也还需要更多的研究去探索。但不管怎么说，这项研究已经为肝细胞癌的研究和治疗打开了一扇新的大门。