骨肉瘤（Osteosarcoma，OS）是一种原发性骨恶性肿瘤，全球每年的发病率约为 3.4/1,000,000 。对于局限性骨肉瘤患者，5 年生存率约为 65 - 70%，但一旦出现转移或复发，生存率会骤降至 30% 以下。当前，新诊断的骨肉瘤主要治疗手段包括新辅助化疗、手术切除以及术后的多轮治疗。然而，由于骨肉瘤具有高度的遗传复杂性和患者间的异质性，其总体预后差异极大 。肿瘤微环境（Tumor Microenvironment，TME）在骨肉瘤的发展过程中起着双重作用，不同类型的免疫细胞，有的能抑制肿瘤生长，有的却会促进肿瘤的进展 。因此，深入了解骨肉瘤进展的分子机制和关键细胞，对于开发新的预后生物标志物和治疗靶点至关重要。

肿瘤纯度指的是肿瘤样本中癌细胞相对于基质细胞和免疫细胞等非癌细胞的比例，它反映了肿瘤微环境的状态，在肿瘤的发展和治疗反应中起着关键作用 。以往研究表明，肿瘤纯度在不同癌症类型中与预后的关系各不相同。在头颈部癌和宫颈癌中，较低的肿瘤纯度与较好的预后相关；而在胶质瘤和结肠癌中，情况则相反 。但在骨肉瘤中，肿瘤纯度与预后的关系尚不明确。目前常用的评估肿瘤纯度的方法，如免疫组化技术和基于全外显子 / 基因组测序的算法（如 ABSOLUTE），受组织和序列数据可用性的限制 。ESTIMATE 算法虽被广泛用于评估骨肉瘤肿瘤纯度，但因其依赖于浸润的基质和免疫细胞，对于骨肉瘤这类基质或免疫相关基因高表达的肿瘤，无法准确推断肿瘤细胞的比例 。

内质网（Endoplasmic Reticulum，ER）蛋白稳态的扰动会触发适应性未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response，UPR），该反应由三种内质网跨膜应激传感器启动：肌醇需求酶 1α（Inositol-requiring Enzyme 1 alpha，IRE1α）、蛋白激酶 R 样内质网激酶（Protein Kinase R-like ER Kinase，PERK）和激活转录因子 6α（Activating Transcription Factor 6 alpha，ATF6α） 。近年来的研究显示，UPR 信号在促进不同癌症的多种特征方面发挥着重要作用，针对 UPR 信号通路关键成分的靶向治疗可能为癌症治疗提供新策略 。此前基于多个骨肉瘤队列的批量转录组数据研究发现，UPR 激活是骨肉瘤的一个常见分子特征 。在 UPR 的三个分支中，ATF6α 在癌症进展中的作用相对研究较少。虽然早期的蛋白质组学研究观察到骨肉瘤组织中 UPR 蛋白，尤其是 ATF6α 分支的蛋白水平高于正常组织，但利用单细胞测序技术确定高表达 ATF6α 的特定细胞亚群及其预后价值，仍有待深入研究。

为了深入探究这些问题，来自昆明医科大学曲靖附属医院、海南大学等单位的研究人员在《BMC Cancer》期刊上发表了题为 “Integrated analysis of single-cell and bulk transcriptomics reveals cellular subtypes and molecular features associated with osteosarcoma prognosis” 的论文。研究人员通过整合单细胞和批量转录组学数据，构建了人类骨肉瘤细胞图谱，开发了肿瘤纯度预测模型，深入研究了与骨肉瘤预后相关的细胞亚型和分子特征，为骨肉瘤的生物学研究、生物标志物发现和治疗策略开发提供了新的见解和重要资源。

在这项研究中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先，他们对多个数据库进行全面搜索，收集已发表的骨肉瘤转录组数据，构建了包含 344 个样本的 meta 队列，并进行批量转录组数据处理和分析 。同时，他们从两个公开的人类单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）骨肉瘤数据集汇总了超过 110,000 个单细胞，经过一系列处理和分析，鉴定出主要细胞类型和细胞状态 。此外，研究人员利用多种机器学习算法，结合单细胞和批量转录组数据，构建并验证了肿瘤纯度预测模型 。还运用了基因富集分析、免疫组化、细胞培养和转染等技术，深入探究相关分子机制和细胞间的相互作用。

研究人员为了探索肿瘤纯度与骨肉瘤预后之间的关系，对骨肉瘤肿瘤纯度与临床和分子特征的相关性进行了评估。他们发现，骨肉瘤肿瘤纯度与不良预后，如复发、转移和死亡，存在显著关联。高肿瘤纯度组的总生存期明显短于低纯度组。这表明肿瘤纯度可能是骨肉瘤潜在的预后指标。然而，常用的 ESTIMATE 算法在评估骨肉瘤肿瘤纯度时存在局限性。该算法内置基因集中的基质基因特征在评估研究人员构建的骨肉瘤 scRNA-seq 图谱时效果不佳，近一半的基质基因表达缺乏特异性，且其推断的基质评分与基质细胞比例的相关性较低。这凸显了开发一种更可靠的骨肉瘤肿瘤纯度评估工具的必要性。

为了开发一种准确的从骨肉瘤基因表达谱估计肿瘤纯度的方法，研究人员设计了一个包含细胞内在基因标记的流程，并基于 TARGET-OS 批量 RNA-seq 数据集和构建的骨肉瘤 scRNA-seq 图谱，应用了多种机器学习模型。最终，他们生成了 15 个人工智能衍生的肿瘤纯度预测模型。通过三个验证数据集的测试，发现大多数算法预测的肿瘤纯度得分与实际纯度之间具有较高的皮尔逊相关系数。与之前发表的四种经典肿瘤纯度评估方法相比，研究人员开发的模型表现更优，其中 GBM 驱动的模型最为有效，被称为骨肉瘤纯度相关特征（OS purity-related signature）。此外，研究还确定了三个经过筛选的具有高效性的细胞内在基因特征，并且发现较高的基质评分和免疫评分都与较好的预后相关。

研究人员在单细胞水平上探索与骨肉瘤进展相关的细胞类型。基于骨肉瘤 scRNA-seq 图谱，他们鉴定出了七种主要细胞类型，包括骨肉瘤细胞（OS cells）、癌症相关成纤维细胞（CAFs）、周细胞（Pericytes）、内皮细胞（Endothelial cells）、T 细胞（T cells）、髓样细胞（Myeloid cells）和破骨细胞（Osteoclasts） 。通过计算优势比（OR）指数发现，T 细胞、破骨细胞和髓样细胞在原发性肿瘤组中分布偏好明显，而骨肉瘤细胞在转移和复发组中更为富集 。利用 BayesPrism 算法对 TARGET-OS 批量 RNA-seq 数据进行反卷积分析，发现骨肉瘤细胞与不良预后相关，而髓样细胞、癌症相关成纤维细胞、破骨细胞、T 细胞和周细胞与较好的预后相关 。这些结果在 GSE21257-OS 微阵列数据集中得到了验证。通过 GO 功能富集分析，还发现了 T 细胞、破骨细胞和髓样细胞与预后相关的共同和独特特征。

研究人员进一步对髓样细胞和破骨细胞进行细分，基于代表性标记将其分为 11 个子集群。运用 Scissor 算法整合 TARGET-OS 数据集的表型数据和髓样细胞的转录组表达谱，发现 Mph_SPP1（占总髓样细胞的 5.17%）可能是与骨肉瘤进展相关的潜在巨噬细胞亚群 。对 T 细胞进行细分得到九个亚集群，Scissor 算法显示大多数 T 细胞亚集群与良好预后相关 。通过比较 Scissor + 细胞（不良预后）和 Scissor - 细胞（良好预后）的转录组谱，揭示了两组细胞中上调的差异表达基因（DEGs）在不同功能通路的富集情况，从而在单细胞分辨率下揭示了免疫细胞内在的与骨肉瘤预后相关的分子特征。

间充质细胞和骨肉瘤细胞是骨肉瘤肿瘤微环境的主要组成部分。研究人员对间充质细胞和骨肉瘤细胞进行聚类分析，根据细胞标记将间充质细胞分为三个亚集群，根据 CNV 计算结果鉴定出六种癌细胞状态，并评估了它们的内在功能特征 。例如，C1_OS_MT + 肿瘤细胞高表达金属硫蛋白相关基因，C2_OS_Oxidative 肿瘤细胞线粒体相关基因表达较高，C3_OS_UPR 细胞高表达内质网应激和 UPR 相关标记基因等 。这些发现揭示了骨肉瘤肿瘤微环境中存在显著的异质性。

运用 Scissor 算法，研究人员发现 C3_OS_UPR 细胞的 log2 比值明显高于其他细胞状态，表明该细胞状态的 UPR 激活与骨肉瘤不良预后相关 。通过 VIPER 算法整合 Scissor + 和 Scissor - 细胞相关特征，证明了它们对总生存期和无进展生存期的预测价值 。GO 分析显示，Scissor + 细胞中上调的 DEGs 主要富集在与骨分化、UPR 信号、细胞外基质功能和血管生成相关的术语，而 Scissor - 细胞中上调的 DEGs 与氧化磷酸化、抗原呈递和加工、白细胞迁移和激活以及干扰素反应相关 。此外，还发现许多 ATF6α 靶基因在 Scissor + 细胞中表达显著增加，GSEA 分析验证了 Scissor + 细胞中 UPR 的激活和 Scissor - 细胞中干扰素 α 反应通路的激活 。这些数据揭示了骨肉瘤进展的关键分子特征，表明特定肿瘤细胞群体中 UPR，特别是 ATF6α 途径的激活与骨肉瘤不良预后密切相关。

研究人员利用 BayesPrism 算法对 TARGET-OS 和 GSE21257 批量转录组数据进行反卷积分析，发现 C3_OS_UPR 肿瘤亚集群在总生存期森林图中排名靠前，与骨肉瘤的无进展生存期也相关，表明该亚集群与骨肉瘤进展显著相关 。SCENIC 分析显示 ATF6α 是 C3_OS_UPR 肿瘤亚集群的顶级转录因子 。通过多种实验验证了 ATF6α 在骨肉瘤肿瘤样本中的高表达，以及其对 HOS 细胞存活的促进作用 。无论是通过基因手段抑制 ATF6α 表达，还是使用药物抑制其活性，都会降低 HOS 细胞的活力、集落形成能力和生长能力。

研究人员发现 C3_OS_UPR 细胞在所有骨肉瘤样本中普遍存在，且其估计比例与肿瘤纯度显著相关 。利用 CellChat 和元细胞计算配体 - 受体对的吸引强度，发现 C3_OS_UPR 亚集群与基质细胞和 CD8Tex 细胞存在活跃的通信 。还描绘了 C3_OS_UPR 与 CD8Tex 细胞之间的通信信号网络，确定了 C3_OS_UPR 癌细胞激活信号通路的主要输入和输出信号 。qPCR 实验进一步支持了 CellChat 的预测结果，为 UPR 相关肿瘤亚集群与肿瘤微环境中其他细胞类型之间的细胞串扰提供了全面的图谱。

这项研究首次确定了肿瘤纯度是骨肉瘤患者预后的预测标志物，高肿瘤纯度往往与较差的预后相关，因为它可能导致免疫和基质细胞浸润不足，形成免疫抑制微环境，降低对治疗的反应 。研究人员开发的基于 GBM 的肿瘤纯度预测模型，相较于现有算法，具有更高的准确性和更广泛的适用性，有望用于患者分层和个性化治疗 。

通过单细胞 RNA 测序分析，研究人员发现骨肉瘤细胞丰度增加与更强的侵袭性和更差的预后相关，而基质细胞和免疫细胞比例较高则与较好的预后相关 。详细剖析免疫细胞状态和分子特征，揭示了髓样细胞和 T 细胞与骨肉瘤预后相关的共性和独特分子模式 。此外，研究还发现了骨肉瘤肿瘤内的异质性，鉴定出六种不同的癌细胞状态，并阐明了它们的功能特征 。特别值得注意的是，确定了 C3_OS_UPR 细胞亚集群与不良预后密切相关，ATF6α 在其中发挥了重要作用 。虽然针对 UPR 途径的治疗存在挑战，但也为开发新的治疗策略提供了方向，如开发高度特异性的抑制剂或联合治疗方案 。

不过，该研究也存在一些局限性。用于验证的批量 RNA-seq 数据集样本量有限，可能降低了统计效力，部分分析未达到统计学显著性 。此外，研究中使用的公开单细胞数据集仅来自亚洲人群，可能无法完全代表其他种族的遗传多样性 。尽管如此，研究人员通过整合内部数据、实验手段和更大的公开批量 RNA-seq 数据集进行验证，一定程度上克服了这些限制 。

总体而言，这项研究强调了肿瘤微环境在骨肉瘤临床决策中的关键作用 。对于低肿瘤纯度的患者，可能从针对免疫或基质成分的治疗中获益；而高肿瘤纯度的患者，可能对针对癌细胞内在途径的治疗反应更好 。研究结果增进了人们对骨肉瘤生物学异质性的理解，为进一步探索肿瘤微环境组成如何影响临床结果提供了有价值的见解，为骨肉瘤的研究和治疗开辟了新的方向。