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为解决白蛉对杀虫剂的抗药性问题，美国农业部研究人员开展了蚊子突变在白蛉乙酰胆碱酯酶中的研究。结果发现新型合成氨基甲酸酯可抑制突变 rPpAChE1。这为开发高效安全杀虫剂提供依据，推荐一读。
在热带和温带地区，有一种疾病虽广泛存在却常被忽视，它就是皮肤利什曼病。每年大约有 100 万人受其影响，致病元凶是利什曼原虫，而传播这种原虫的 “罪魁祸首” 之一就是白蛉（Phlebotomus papatasi） 。白蛉在中东、亚洲、非洲和南欧等地 “肆虐”，是动物源性皮肤利什曼病的主要传播媒介。而且，白蛉叮咬还严重影响了美军在伊拉克和阿富汗的军事行动。
为了控制白蛉传播疾病，人们想出了不少办法，比如减少啮齿动物栖息地、用昆虫生长调节剂处理宿主啮齿动物以减少白蛉数量，使用诱捕有毒糖饵、室内杀虫剂喷雾，还有经过杀虫剂处理的蚊帐，以此降低白蛉叮咬人类的几率。然而，问题来了，白蛉对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂产生了抗药性。昆虫疾病传播媒介的乙酰胆碱酯酶（AChE[1]）发生点突变，使得它们对抗胆碱酯酶杀虫剂的敏感性降低。在冈比亚按蚊和致倦库蚊中，导致对高剂量抗胆碱酯酶产生抗性的主要突变是 G119S。之前研究发现，重组巴氏白蛉乙酰胆碱酯酶（rPpAChE1）与蚊子 AChE 的氨基酸序列有 85% 的一致性，还找到了能选择性抑制 rPpAChE1 且能避开 G119S 突变的合成氨基甲酸酯。但对于蚊子中与抗药性相关的 F290V 和 F331W 突变，在巴氏白蛉中的研究还比较缺乏。
为了解决这些问题，美国农业部农业研究服务局 Knipling-Bushland 美国牲畜昆虫研究实验室的 Kevin B. Temeyer 等人，在《Parasites & Vectors》期刊上发表了名为 “Mosquito mutations F290V and F331W expressed in acetylcholinesterase of the sand fly Phlebotomus papatasi (Scopoli): biochemical properties and inhibitor sensitivity” 的论文。研究发现，蚊子 AChE 的 F290V、F331W 和 G119S 等突变会显著降低对白蛉 rPpAChE1 的抑制敏感性，多个突变组合表达时催化活性会丧失。不过，研究人员也发现了新型合成氨基甲酸酯，它能有效抑制携带这些突变的 rPpAChE1。这一成果意义重大，新型氨基甲酸酯有望开发成更有效的杀虫剂，对表达突变 AChE 的白蛉或蚊子种群更具特异性，安全性也更高。
在研究中，研究人员用到了几个关键技术方法。他们利用杆状病毒系统在 Sf21 细胞中表达了带有或不带有 F290V、F331W 和 G119S 突变的重组 PpAChE1。还通过定点诱变构建了含有这些突变的 rPpAChE1 突变体。另外，使用改良的 Ellman 测定法，来检测野生型和突变型 rPpAChE1 的催化特性和抑制剂敏感性变化。
下面我们来看看具体的研究结果。
- rPpAChE1 突变体的定点诱变和杆状病毒表达：研究人员成功构建了 rPpAChE1 突变体，包括单个突变体（rPpAChE1G119S、rPpAChE1-F290V 和 rPpAChE1-F331W）和多个组合突变体（rPpAChE1-G119S-F290V、rPpAChE1-G119S-F331W、rPpAChE1-F290V-F331W 和 rPpAChE1-G119S-F290V-F331W），并通过测序验证了这些突变体在 rPpAChE1 cDNA 预期核苷酸位置含有 G119S、F290V 和 F331W 同源密码子。
- rPpAChE1 中表达的蚊子突变 F290V、F331W 和 G119S 的特性：研究发现，携带单个有机磷抗性（OPR）突变 G119S、F290V 或 F331W 的重组 PpAChE1，对底物乙酰硫代胆碱的米氏常数（K<sub>m</sub>）增加，这意味着底物结合能力变差；对氧磷和马拉氧磷抑制的敏感性降低。多个突变组合表达时，rPpAChE1 检测不到 AChE 活性。从 K<sub>m</sub>值来看，野生型 rPpAChE1 和 G119S、F290V、F331W 突变体的 K<sub>m</sub>值分别为 123、156、367 和 474 μM 乙酰硫代胆碱。而且，这些突变还使最大反应速度（V<sub>max</sub>）降低，相对 V<sub>max</sub>/K<sub>m</sub>值大幅下降，说明催化效率显著降低，只有野生型的 6% - 16%。
- 生化表征和抑制试验：对氧磷和马拉氧磷对野生型 rPpAChE1 抑制作用很强，但对 rPpAChE1-G119S 或 rPpAChE1-F331W 的抑制作用就弱很多。rPpAChE1-F290V 对这两种抑制剂也有抗性，但抗性比 G119S 或 F331W 突变体要低。不同类型的抗胆碱酯酶抑制剂对表达的 rPpAChE1 突变体抑制效果差异很大。催化位点抑制剂和二价抑制剂对野生型 rPpAChE1 酶活性抑制作用较强，IC<sub>50</sub>值大多在 3 - 76 nM 之间；而两个外周位点抑制剂对 rPpAChE1 的抑制效力相对较低。rPpAChE1-G119S 对有机磷（对氧磷和马拉氧磷）、呋喃丹和苯基取代的甲基氨基甲酸酯类表现出很强的抗性，抗性比超过 450，但对一些烷基取代的吡唑氨基甲酸酯（如化合物 3 - 5）抗性比低很多。rPpAChE1-F290V 对部分酰化位点抑制剂敏感性降低，但对 tubocurarine（一种外周位点抑制剂）的敏感性与野生型相同，对溴化乙锭敏感性增加。rPpAChE1-F331W 对有机磷抗性强，对呋喃丹和合成氨基甲酸酯敏感性低，大多数抑制剂的抗性比小于 45。
- 用不同长度的他克林和他克林二聚体探究峡谷几何形状：未改变的 rPpAChE1 和表达蚊子突变 G119S、F290V 和 F331W 的构建体对不同长度的他克林和他克林二聚体反应不同。F290V 构建体对他克林抗性增加，但对所有 bis (n)- 他克林二聚体敏感性增加；G119S 和 F331W 构建体对他克林和几乎所有 bis (n)- 他克林二聚体抗性增加，不过 G119S 构建体对 bis (9)- 他克林二聚体敏感性比未改变的 rPpAChE1 高，F331W 构建体对他克林或 bis (n)- 他克林二聚体的整体抑制敏感性下降最大。
综合研究结果和讨论部分，这项研究意义非凡。它填补了巴氏白蛉和蚊子对有机磷和氨基甲酸酯抗性机制研究的空白。研究发现 G119S 突变显著影响 rPpAChE1 的催化特性和对抑制剂的敏感性，不同结构的氨基甲酸酯类抑制剂对突变体的抑制效果不同，这为理解抗性机制提供了重要线索。携带这些突变的重组酶可用于建立结构 - 活性关系（SAR）模型，进行体外筛选，有助于设计针对杀虫剂不敏感 AChE 的高效特异性抑制剂，且能提高对哺乳动物的安全性。此外，研究还强调了杀虫剂管理的重要性，合理使用杀虫剂结合其他技术，能减少抗性的产生和固定。未来还需进一步研究 PpAChE1 其他突变的影响，评估自然种群中 G119S 同源密码子多态性，利用人工智能算法筛选更有效的合成配体，开发对非靶标生物更安全的白蛉抗胆碱酯酶杀虫剂，为控制白蛉传播疾病提供更有力的支持。
