在细胞与细胞外基质的相互作用中，整合素（Integrins）扮演着不可或缺的角色。它作为主要的黏附受体，将细胞的肌动蛋白细胞骨架与细胞外基质（ECM）相连，广泛参与器官发生、血管生成、免疫反应等生理过程，同时在癌症转移、凝血障碍等多种疾病的发生发展中也起到关键作用。然而，整合素在细胞表面存在动态平衡的两种构象 —— 无活性（弯曲 - 闭合、低亲和力）和有活性（伸展 - 开放、高亲和力），目前对于调控其构象转变的信号转导通路，科学家们还未完全掌握。深入研究整合素的激活机制，不仅有助于揭示相关生理和病理过程的奥秘，还可能为开发新型治疗策略提供关键靶点，因此这一领域的研究备受关注。

1. 构建 β₁IAS：通过将 Promega NanoLuc Binary Technology（NanoBiT）分裂荧光素酶的两个亚基（LgBiT 和 SmBiT），用 15 个氨基酸长的 Gly-Ser 连接子插入人 β₁整合素的 S₇₉-K₈₅环，构建出 β₁IAS。
2. 细胞模型建立：利用 CRISPR-Cas9 系统，在人永生化主动脉内皮细胞（TeloHAECs）中插入 β₁IAS 编码序列，获得稳定表达 β₁IAS 的细胞系（β₁IAS KI ECs）；同时使用 β₁整合素敲除的小鼠胚胎成纤维细胞（β₁^-/- MEFs）进行相关实验。
3. 高通量筛选（HTS）：运用人可药物基因组 v.3 siRNA 文库，对 β₁IAS KI ECs 进行发光 siRNA HTS，筛选出 β₁整合素激活的潜在调控基因。
4. 蛋白质组学分析：采用质谱（MS）技术分析经血管内皮生长因子 B（VEGF-B）刺激后的 TeloHAECs 的磷酸化蛋白质组变化。

1. β₁IAS 的设计与功能验证：研究人员基于整合素激活时的构象变化，选择在 β₁整合素胞外区域的关键位置插入 NanoBiT 分裂荧光素酶，构建了 β₁IAS。实验表明，重组的 β₁IAS 胞外部分在溶液中能有效报告 β₁整合素的构象激活状态。将 β₁IAS 转导至 β₁^-/- MEFs 或在 β₁IAS KI ECs 中表达，发现它能感知多种刺激引起的 β₁整合素构象激活变化，且在活细胞中表现为在真实的 ECM 黏附位点发光，证明 β₁IAS 是一种有效的发光传感器。
2. β₁整合素激活调控因子的筛选：通过对 β₁IAS KI ECs 进行 siRNA HTS，研究人员分析了 2970 个表达基因沉默后的发光数据，发现了 194 个统计学上显著的候选基因，这些基因是 β₁整合素激活的正（142 个）或负（52 个）调控因子。生物信息学分析显示，候选基因主要富集在整合素介导的焦点黏附形成和信号通路、血管内皮生长因子（VEGF）信号通路等相关途径。
3. E3 泛素连接酶 Pja2 的作用机制：研究发现 E3 泛素连接酶 Pja2 是 β₁整合素激活的有效负调控因子。在 β₁IAS KI ECs 中，Pja2 缺失会导致发光增加，而转导沉默抗性的小鼠 Pja2（mPJA2）可减弱这种增加。进一步研究表明，Pja2 通过促进黏着斑蛋白 kindlin-2 的泛素化降解，降低其蛋白水平，从而抑制 β₁整合素激活和焦点黏附形成。
4. VEGF-B 对 β₁整合素激活的抑制作用：筛选结果显示 VEGF-B 是最强的 β₁整合素激活抑制剂。外源性 VEGF-B 刺激可挽救内源性 VEGF-B 沉默导致的 β₁IAS KI ECs 发光增加。机制研究发现，VEGF-B 可能通过调节与细胞黏附和细胞骨架组织相关蛋白的磷酸化水平，如抑制 SHANK3 和 MICAL3 的磷酸化，来抑制 β₁整合素激活。

打赏

下载安捷伦电子书《通过细胞代谢揭示新的药物靶点》探索如何通过代谢分析促进您的药物发现研究

10x Genomics新品Visium HD 开启单细胞分辨率的全转录组空间分析！

欢迎下载Twist《不断变化的CRISPR筛选格局》电子书

单细胞测序入门大讲堂 - 深入了解从第一个单细胞实验设计到数据质控与可视化解析

下载《细胞内蛋白质互作分析方法电子书》