《Cell Reports Methods》：Spatiotemporal analysis of ratiometric biosensors in live multicellular spheroids using SPoRTS
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在癌症研究中，多细胞球体（spheroids）研究面临工具和方法有限的问题。研究人员开展了 “利用 SPoRTS 对活多细胞球体中比率型生物传感器进行时空分析” 的研究。结果显示 SPoRTS 能有效分析生物活动，与传统方法结果相关性强。该研究为球体生物学研究提供新工具。
在癌症研究的舞台上，多细胞球体（spheroids）作为一种备受瞩目的细胞培养模型，正逐渐崭露头角。它与传统的二维单层培养相比，有着诸多独特的优势，尤其是在模拟肿瘤微环境方面表现卓越。以上皮性卵巢癌（EOC）研究为例，多细胞球体被视为肿瘤转移进展的关键介质，其独特的性质，如对细胞凋亡（anoikis）的抵抗能力，使得它们在癌症转移过程中能够存活下来。
然而，多细胞球体内部存在着复杂的微环境异质性。由于球体内部细胞的分布特点，内部细胞会面临缺氧、营养缺乏和废物积累等问题，这导致球体核心区域的细胞与表面细胞在生物学特性上存在巨大差异。但现有的研究方法却难以对这些空间差异进行有效的分析。像常用的批量材料分析技术，如逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）、蛋白质免疫印迹（western blot）等，缺乏空间分辨率，无法区分球体不同区域细胞的差异。一些光谱和基于探针的方法虽然能研究球体生物学的空间方面，但存在需要专业设备、测量种类有限、难以应用于大样本量以及对活样本操作过多等问题。空间分析的图像技术也存在不足，无法真正满足监测活球体中生物活动的需求。在这种情况下，开发一种能够有效分析多细胞球体中生物活动空间差异的方法迫在眉睫。
来自加拿大韦仕敦大学（Western University）的研究人员挺身而出，开展了一项极具意义的研究。他们开发了一种名为 SPoRTS（spatial profiling of ratiometric trends in spheroids）的开源工作流程，这是一个基于 Python 的高通量图像分析平台，旨在通过对活球体荧光比率型生物传感器的时空分析，深入探索球体生物学。
研究人员为开展此项研究，主要运用了以下关键技术方法：首先是构建表达比率型生物传感器的细胞系，如利用转导和转染技术构建了表达基于荧光泛素的细胞周期指示剂（rFUCCI）的 ES2 细胞系；其次是采用时间序列成像技术，使用 IncuCyte S3 活细胞分析系统对活球体进行成像；最后利用 SPoRTS 平台进行图像分析，同时通过免疫荧光分析作为对照验证结果。
研究结果如下：
- SPoRTS 的原理和概述：SPoRTS 的主要功能是从表达比率型生物传感器的球体双通道图像中提取空间比率数据。它首先识别球体的几何中心，沿着从该点辐射出的八条线提取每个通道的强度数据，然后将这些数据转换为线比率剖面，并计算球体的平均比率剖面，最后汇总和平均比率剖面以确定整体表型。此外，SPoRTS 还能生成各种图形输出和比率映射图像，方便结果的可视化和分析。
- 组成型表达的荧光蛋白（FPs）在球体中的独特强度分布：研究发现许多 FPs 在球体核心区域的荧光强度会降低，这与 FPs 发色团形成需要氧气以及球体内部缺氧的环境有关。而且不同的 FP 种类和不同细胞系形成的球体，其 FP 强度分布存在差异。为解决这一问题，SPoRTS 设计了组成型校正功能，通过经验收集的强度数据对原始比率生物传感器数据进行校正，以消除 FP 强度差异对结果的影响。
- SPoRTS 的工作流程：包括比率剖面的获取、原始比率数据的组成型校正、比率数据的区域分割以及比率映射图像和二维组成型校正等步骤。在比率剖面获取过程中，SPoRTS 使用既定的 Python 包进行图像的处理、数据的提取和输出的生成。通过对输入图像文件名进行编码，定义通道，进行背景扣除、前景掩码生成等一系列操作，最终计算出比率剖面。组成型校正则是通过从组成型表达 FP 的球体中提取强度剖面数据，并在后续比率分析中进行校正。区域分割是将比率剖面数据分割成用户定义的区域，以便进行区域间的比较。比率映射图像能够直观地展示球体中比率的分布情况，并且 SPoRTS 生成的比率映射图像具有诸多优势，如结合二维组成型校正、可配置颜色缩放等。
- 活球体中增殖指数的空间估计：研究人员利用已知的增殖细胞主要存在于球体最外层的现象，通过监测 ES2-rFUCCI 球体中增殖细胞的动态空间富集情况，验证了 SPoRTS 的实用性。研究发现，在球体形成早期，增殖细胞分布均匀，随着时间推移，逐渐在球体周边区域富集，这种富集现象在 24 小时左右达到峰值，并持续一段时间后开始减弱，但在实验结束时仍然明显。
- 与现有方法的比较：SPoRTS 在算法上具有独特性，其实现的全自动线剖面采集在现有方法中是独一无二的。研究人员将 SPoRTS 分析结果与球体冷冻切片中增殖标记物的空间量化免疫染色结果进行比较，发现两者具有很强的相关性。其中，SPoRTS 对 rFUCCI 表达球体的分析与 Geminin 染色的相关性最强，这表明 SPoRTS 具有高度的特异性。
研究结论和讨论部分指出，SPoRTS 作为一种开源的图像分析平台，为活球体中比率型生物传感器的空间分析提供了有力的工具。它能够实现对生物过程的动态监测，有助于深入理解空间异质性对细胞信号传导过程的影响，推动球体生物学的发展。不过，该研究也存在一些局限性。例如，图像质量对 SPoRTS 分析至关重要，非均匀的氧合作用会影响 FPs 的使用，组成型校正虽然能提高准确性，但收集数据较为繁琐，且不适用于多状态比率型 FPs。此外，球体的形态可能会干扰 SPoRTS 分析结果的解释，而且 SPoRTS 并非定量分析方法，更适合与其他方法结合进行多模态分析。尽管如此，SPoRTS 的出现仍然为多细胞球体研究开辟了新的道路，相信在未来的研究中，它将不断完善，为癌症研究等领域带来更多有价值的成果。该研究成果发表在《Cell Reports Methods》上，为相关领域的研究提供了重要的参考。
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