《Heliyon》：Reverse transcription-quantitative PCR assays for detecting SARS-CoV-2 using subgenomic RNA load
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为解决传统 PCR 检测 SARS-CoV-2 存在的不足，以及评估针对亚基因组 RNA（sgRNA）的逆转录定量 PCR（RT-qPCR）检测在啮齿动物模型中的有效性问题，研究人员开展了相关研究。结果显示，E-sgRNA RT-qPCR 检测与病毒培养结果相关性最强。这为追踪病毒复制提供了可靠替代方法。
2019 年末，新冠病毒（SARS-CoV-2）突如其来，迅速引发了全球大流行的新冠肺炎（COVID-19）。这场疫情给全球公共卫生带来了巨大挑战，也让科研人员们争分夺秒地投入到相关研究中。在病毒检测方面，传统的聚合酶链式反应（PCR）主要针对病毒基因组 R
NA（gRNA），但它存在一些问题。比如，在康复患者症状出现数周后，即便病毒培养呈阴性，通过逆转录定量 PCR（RT-qPCR）仍能检测到 gRNA ，这说明传统 PCR 用于检测病毒存在并不充分。而亚基因组 RNA（sgRNA）作为病毒活跃复制时才会产生的物质，被认为是更精准的标记，但此前针对 sgRNA 的 RT-qPCR 检测在啮齿动物模型中评估病毒载量和传染性的有效性尚未得到验证。
为了解决这些问题，国防医学院预防医学研究所等机构的研究人员开展了一项重要研究。他们开发了四种针对 SARS-CoV-2 基因（ORF1ab、N、E 和 E-sgRNA）的 RT-qPCR 检测方法，以及两种针对啮齿动物管家基因（仓鼠的 Gapdh 和小鼠的 Actb）的检测方法。研究最终发现，这些检测方法具有高扩增效率和良好的线性相关性，其中 E-sgRNA RT-qPCR 检测与病毒培养结果的相关性最强。这一研究成果发表在《Heliyon》杂志上，为 SARS-CoV-2 的研究提供了新的有力工具，有助于更准确地评估病毒载量和传染性，对疫苗研发、治疗效果评估等方面都有着重要意义。
研究人员在开展此项研究时，主要运用了以下关键技术方法：首先，从感染 SARS-CoV-2 的啮齿动物（42 只叙利亚仓鼠和 60 只 K18-hACE2 小鼠）的肺组织获取样本。然后进行 RNA 提取，利用设计好的引物进行 RT-qPCR 检测，通过构建标准曲线来定量基因拷贝数。同时，对样本进行病毒培养，以便与 RT-qPCR 检测结果对比分析 。
下面来详细看看研究结果：
- RT-qPCR 检测的精准度：研究人员对 ORF1ab、N、E、E-sgRNA、Hamster Gapdh 和 Mice Actb 基因进行检测，结果显示这些基因的扩增效率在 90%-97% 之间，循环阈值（Ct）值与基因对数拷贝数的线性相关性（R2）在 0.9933 - 0.9996 之间。并且，实验室内和实验室间的检测变异系数都较低，分析灵敏度高，最低检测限为 1 - 10 拷贝 / 微升。这表明该检测方法精准度高，能够稳定、可靠地检测目标基因。
- 在啮齿动物肺组织中的检测性能评估：通过对感染 SARS-CoV-2 的啮齿动物肺组织样本进行病毒培养，确定了阳性和阴性样本数量。以此为基准评估 RT-qPCR 检测的诊断效能，结果发现在仓鼠和 K18-hACE2 小鼠中，针对不同基因的 RT-qPCR 检测的灵敏度和特异性有所差异。例如，在仓鼠中，E-sgRNA 检测的灵敏度为 0.97，特异性为 1.0；在 K18-hACE2 小鼠中，E-sgRNA 检测的灵敏度为 0.92，特异性为 0.96。这说明不同基因的检测在不同动物模型中的表现存在差异。
- RT-qPCR 检测病毒载量的性能：将四种 RT-qPCR 检测（ORF1ab、N、E、E-sgRNA）的结果与病毒培养的空斑形成单位对比，发现病毒拷贝数与培养结果显著相关，其中 E-sgRNA RT-qPCR 检测与病毒载量的相关性最强，皮尔逊相关系数达到 0.93（span data-custom-copy-text="\(p0.001\)"p<0.001）。这进一步证明了 E-sgRNA 在检测病毒复制方面具有独特优势。
综合研究结论和讨论部分，本次研究成功开发并验证了四种能够灵敏检测 SARS-CoV-2 的 RT-qPCR 检测方法。这些方法利用管家基因进行标准化，为啮齿动物模型中病毒载量的定量提供了可行的替代方法。虽然针对 gRNA 的检测能发现更高的拷贝数，但针对 E-sgRNA 的检测与病毒培养结果的相关性更好，这意味着 sgRNA 可以作为啮齿动物模型中病毒活跃复制的准确指标。这一研究成果对于深入了解 SARS-CoV-2 在动物模型中的复制机制、评估疫苗和治疗效果等方面都具有重要意义，为后续的相关研究奠定了坚实基础。
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