综述:分子即时检验技术:现状与挑战

《Nexus》:Molecular Point-of-Care Testing Technologies: Current Status and Challenges

【字体: 时间:2025年02月19日 来源:Nexus

编辑推荐:

  本文是关于分子即时检验(POCT)技术的综述。文章详细介绍了分子 POCT 技术的应用范围、检测步骤、研究进展、监管标准及面临的挑战。强调其在传染病、癌症诊断和个性化医疗中的重要性,以及对推动联合国可持续发展目标的意义。

  

一、引言

在现代医疗体系中,即时检验(POCT)技术愈发重要。传统的集中式实验室诊断虽有高灵敏度和特异性,但样本需送往实验室检测,周转时间(TAT)长,不利于传染病的及时诊断和防控。POCT 技术能在检测现场快速得出结果,满足了临床需求。世界卫生组织(WHO)提出的 REASSURED 标准,为 POCT 技术的发展提供了指导框架,涵盖实时连接、样本采集便捷性、可负担性、灵敏度、特异性、用户友好性等多个方面。分子 POCT 技术基于核酸检测,在诊断精准度和灵敏度上有独特优势,本文将聚焦该技术,探讨其发展现状、面临的挑战以及未来的发展方向。

二、分子 POCT 的应用范围

分子 POCT 在传染病诊断方面表现卓越,能够快速、灵敏地检测出病原体的核酸。相比基于免疫分析的 POCT 方法,分子 POCT 在早期传染病检测和基因突变检测上,灵敏度和特异性更高。它还能通过检测病原体的基因突变,助力公共卫生部门及时发现新的病毒变种,制定防控策略。例如,在新冠疫情期间,分子 POCT 技术对控制病毒传播起到了关键作用。
在个性化医疗领域,分子 POCT 可进行快速药物基因组检测。通过检测与药物代谢和反应相关的基因变异,医生能为患者制定更精准的药物治疗方案,提高治疗效果,减少不良反应。此外,分子 POCT 在癌症筛查方面也有应用潜力,以宫颈癌筛查为例,检测人乳头瘤病毒(HPV)的分子 POCT 技术,有助于及时发现病毒感染,阻止疾病进展,尤其对中低收入国家意义重大。分子 POCT 的应用场景广泛,包括医院急诊室、诊所、家庭等,甚至在外太空探索中也能发挥重要作用。

三、分子 POCT 的检测步骤

(一)样本采集和存储

样本采集和存储是分子 POCT 的重要环节。不同的诊断目的需要不同类型的样本,如血液、鼻咽喉拭子、唾液、尿液和粪便等。血液样本可用于诊断传染病和进行个性化医疗,但传统的血液采集和存储方法在 POCT 应用中存在不便。目前有一些商业化的卡片,如 Flinders Technology Associates(FTA)Cards?,可用于样本的采集和存储,方便现场样本的运输和后续检测。
鼻咽喉拭子是诊断呼吸道感染的常用样本,在新冠疫情期间被广泛应用。阴道拭子用于检测性传播感染(STIs),颊拭子则常用于遗传检测。唾液样本具有非侵入性采集的优势,可用于监测口腔健康、检测传染病和评估遗传变异,已有多种商业化的唾液采集管可供使用。尿液样本可用于诊断泌尿系统感染、性传播疾病和代谢紊乱,但其生物标志物浓度可能较低,有时需要对样本进行富集处理。粪便样本对于诊断胃肠道感染、炎症性肠病和结直肠癌筛查具有重要价值,不过样本处理相对复杂。

(二)核酸提取和纯化

核酸提取和纯化是分子生物学和诊断的关键步骤,旨在从样本中释放核酸,并去除 PCR 抑制剂和污染物,保证核酸的质量。对于 POCT 应用,这一步骤需要在保证产量和纯度的同时,提高速度和效率。微流控和墨盒式方法常用于支持自动化流程,并与下游检测过程集成。一些无需设备的核酸提取和纯化方法也被开发出来,如基于注射器的提取方法和核酸提取试纸法,这些方法操作简单、成本低,适合家庭使用。此外,对于某些样本类型,如血液、鼻拭子和唾液,可直接进行遗传检测,无需核酸提取,简化了检测流程。

(三)核酸扩增

  1. 聚合酶链反应(PCR):PCR 是目前最成熟可靠的核酸扩增技术,能够在短时间内将目标 DNA 分子扩增数十亿倍,大大提高了核酸检测的灵敏度。然而,PCR 对精确的温度控制和稳定的电源有较高要求,限制了其在一些 POCT 场景中的应用。随着技术的发展,便携式 PCR 机器应运而生,这些设备多为电池供电,体积小巧,能够在分散化的检测场景中实现快速核酸扩增,如在基层医疗机构、社区和现场检测中发挥重要作用。
  2. 等温扩增方法:等温扩增技术,如环介导等温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)等,是分子诊断领域的重要进展。与 PCR 不同,等温扩增反应在恒定温度下进行,无需复杂的温度循环设备,检测时间通常比 PCR 更短,对样本抑制剂的耐受性也更高。LAMP 技术利用 Bst 聚合酶和特定引物,在 60 - 70°C 左右即可扩增目标核酸,在新冠疫情期间被广泛应用于快速检测。RPA 技术则在 37 - 42°C 下进行反应,能够快速灵敏地检测目标核酸,并且可以与可穿戴设备等集成,实现便捷的检测。不过,等温扩增技术也存在一些问题,如 LAMP 引物设计复杂,容易出现非特异性扩增;RPA 对探针和靶序列错配的耐受性较高,可能影响检测的特异性,且目前等温扩增技术在病毒载量定量方面还存在不足。

(四)信号生成和检测

  1. 荧光信号:荧光信号检测是常用的核酸检测方法,具有高灵敏度和定量准确的优点,能够精确检测 DNA 扩增产物的数量,还能通过荧光探针区分相似序列或检测单核苷酸多态性(SNPs)。然而,荧光检测需要专门的设备,这些设备通常体积庞大、结构复杂且成本较高,限制了其在 POCT 中的应用,因此荧光检测系统的小型化至关重要。
  2. 比色信号:比色检测是一种简单直观的检测方法,通过肉眼即可观察信号,无需专业设备,适合家庭和现场检测。在 DNA 扩增过程中,利用 pH 敏感染料或金纳米颗粒(NPs)等可以产生比色信号。例如,pH 敏感染料在 DNA 扩增时会因溶液 pH 值的变化而变色,金纳米颗粒则可用于构建简单的比色核酸检测方法,如基于金纳米颗粒的侧向流动分析(LFA)。此外,还有一些新型的纳米颗粒探针,如用吗啉代寡核苷酸(MOs)功能化的金纳米颗粒,具有高特异性的核酸识别能力。
  3. 电化学信号:电化学方法通过电活性嵌入剂或标记有氧化还原分子的探针来产生电化学信号,具有无需复杂光学组件、易于小型化和数字化输出等优点,能够方便地集成到便携式设备中,用于 POCT 检测。例如,Roche cobas? eplex 系统利用氧化还原分子标记的 DNA 杂交探针实现电化学传感,可进行多重检测。
  4. CRISPR - 基于的系统:基于成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)系统的核酸检测平台近年来受到广泛关注。CRISPR 系统能够识别并切割特定的核酸序列,基于此开发的检测策略可用于靶向检测特定的遗传序列。CRISPR - Cas 系统包括 Cas9、Cas12、Cas13 和 Cas14 等,在识别目标序列后,会产生非特异性切割单链核酸分子的活性,从而产生可检测的信号。该系统可实现等温检测,简化了检测流程,但检测灵敏度相对 PCR 较低。
  5. 纳米孔测序:纳米孔测序是第三代测序技术,能够直接对目标序列进行测序,具有可移动、成本较低和可扩展性强等优点,在资源受限的环境中也能使用。在新冠疫情期间,纳米孔测序被用于监测病毒变种和新的疫情爆发,但该技术需要专业人员操作,且准确性还有待提高。

四、集成 “样本进 - 结果出” 系统

在医院急诊室、社区诊所等场所,实现便捷快速的诊断是 POCT 的重要目标,集成 “样本进 - 结果出” 系统是关键。这类系统通常基于微流控芯片和墨盒技术,将核酸检测的多个步骤整合到一个平台上,简化了检测流程,减少了人为操作误差,提高了检测的准确性和可靠性。目前市场上有多种商业化的集成系统,如基于 qPCR 的 Cepheid GeneXpert 系统和 BioFire's FilmArray 系统,以及基于电化学检测的 Roche cobas? eplex 系统等。
Cepheid GeneXpert 系统将核酸提取、扩增和检测集成在一个墨盒式工作流程中,操作简便,检测快速,被广泛应用于新冠病毒监测、结核病诊断等领域。BioFire's FilmArray 系统则在一个一次性袋子中完成核酸检测的各个步骤,具有高通量、高灵敏度的特点,在传染病诊断方面应用广泛。然而,这些集成系统也存在一些局限性,如设备体积较大、成本较高,需要稳定的电力供应和温度控制,且一次性芯片和墨盒的成本也限制了其在资源受限地区的应用。

五、无设备分子 POCT

无设备分子 POCT 是满足资源受限地区和个人自我检测需求的重要发展方向。在缺乏实验室基础设施的地区,无设备 POCT 解决方案对于及时诊断至关重要。实现无设备分子 POCT 需要简单的样本制备方法,如基于注射器和纸张的核酸提取和纯化方法,这些方法操作简单,无需专业设备,适合非专业人员使用。
在核酸扩增方面,等温扩增技术是理想的选择,其反应条件温和,有时甚至在常温下即可进行,必要时也可通过简单的加热设备进行调控。比色检测方法因其无需额外检测设备,可通过肉眼观察结果,成为无设备 POCT 的常用检测方法,并且可以通过手机拍照记录结果,实现与医生的远程沟通。将这些步骤整合到一个简单的检测系统中时,需要注意防止扩增产物的污染,减少操作时间,以提高检测的可靠性。例如,一种用于检测新冠病毒的无设备 POCT 检测方法,结合了直接等温扩增和比色检测,能够在 30 分钟内完成检测,适合家庭自我检测。

六、分子 POCT 的监管要求

(一)监管的必要性

随着实验室技术向实际应用的转化,确保体外诊断(IVD)产品的质量、安全和可靠性至关重要。监管机构,如美国食品药品监督管理局(FDA)、欧洲体外诊断法规(IVDR)、中国国家药品监督管理局(NMPA)和 WHO 等,制定了一系列标准和法规,要求进行质量体系认证,以保障患者安全和市场信任。这些法规随着技术发展和健康需求的变化不断更新,技术和产品开发者需要严格遵守。

(二)监管机构关注的重点

监管机构主要关注产品分类和风险评估、技术验证文件以及性能和安全标准的遵守情况。IVDR 将 IVD 产品分为四个风险类别,分子 POCT 通常属于较高风险类别(C 或 D),需要大量的临床证据和性能评估才能获得市场批准。在验证过程中,监管机构注重检测的高灵敏度(检测真阳性)和特异性(避免假阳性),特别是在传染病和癌症诊断等关键领域。此外,分析灵敏度和特异性评估还包括检测限(LoD)、交叉反应研究和包容性分析等,同时也会考虑检测的重复性、环境稳定性和稳健性等因素。

(三)资质和质量管理系统(QMS)

获得质量系统认证,如 FDA 的质量系统法规(QSR)或符合 IVDR 的 QMS,是产品进入市场的关键步骤,确保产品的研发和生产过程符合严格的质量标准。QMS 要求包括产品开发生命周期的清晰记录、风险管理实践和验证协议等,还涉及人因工程,以确保非专业用户能够准确操作设备。WHO 的 IVD 预认证过程侧重于与可用性、可负担性和耐用性相关的 QMS 方面,特别是针对资源受限地区的设备。

(四)FDA、IVDR、WHO 和 NMPA 之间的差异

FDA、IVDR、WHO 和 NMPA 是全球主要的监管系统,不同国家可能采用不同的监管体系。它们在技术验证的文件要求上有相似之处,但也存在明显差异。IVDR 要求最为严格且不断发展,FDA 的要求在严格标准和鼓励创新之间取得平衡,WHO 更关注全球健康应用中诊断设备的可负担性和可及性,NMPA 则强调本地化标准,特别是针对分子诊断产品的临床试验要求。

(五)POCT 设备审批的案例研究

以 Cepheid’s Xpert? Xpress SARS-CoV-2 Test 为例,该设备采用实时 RT-PCR 技术,满足 POCT 应用的高灵敏度要求。在不同监管机构的审批过程中,FDA 的紧急使用授权(EUA)途径审批速度快、灵活性高,但为临时授权,后续需寻求正式批准。欧盟 IVDR 实施前,该设备通过自我声明符合 IVDD 获得 CE-IVD 认证,IVDR 实施后则需由指定机构评估批准。中国在新冠疫情期间实施了类似 EUA 的特别紧急审批途径,该设备于 2020 年初获得 NMPA 批准,且中国更注重国内临床试验数据和 GMP 合规审计。WHO 的紧急使用清单(EUL)有助于该设备在全球低资源地区的采购和应用,但不替代国家监管批准,还需进行现场评估。

七、分子 POCT 的全球推广

随着对分子 POCT 变革潜力的认识不断提高,国际上推广分子 POCT 的努力日益加强,旨在满足紧急医疗需求,改善低资源地区的医疗结果。然而,在全球推广过程中面临诸多挑战。
分子 POCT 的初始设置成本和每次检测费用较高,尤其对于低中收入国家(LMICs)来说负担较重。许多分子 POCT 平台使用集成的 “样本进 - 结果出” 设备,其一次性消耗品成本高昂,限制了大规模应用。为解决这一问题,可采用合作资助机制、公私合作伙伴关系和滑动定价模型等策略,同时通过技术创新降低成本,如开发微流控、自动化和可重复使用的设备组件等。
质量控制是确保分子 POCT 设备提供可靠准确结果的关键。需建立外部质量评估计划和标准化操作程序,与国际监管机构合作并遵守全球认可的标准,如 ISO 认证,以加强质量保证工作。
有效的 POCT 实施依赖于训练有素的专业人员。分子 POCT 涉及复杂精确的实验流程,人员培训不足可能导致检测误差。可通过在线培训平台、现场研讨会和认证计划等方式,提高医疗工作者的技能水平。
将 POCT 数据无缝集成到更广泛的健康信息系统中至关重要,但目前 POCT 设备与电子健康记录(EHRs)之间的互操作性存在问题,数据安全也是关键问题。需采用通用数据标准、安全加密协议和强大的数据共享框架,以实现数据的可靠传输和有效利用,人工智能(AI)和移动健康(mHealth)技术在这一过程中可发挥重要作用。
可靠的供应链是保证 POCT 设备和消耗品持续供应的基础,但目前存在设备和试剂短缺、物流中断和配送网络低效等问题。可通过与当地制造商合作、优化库存管理等方式加强供应链。
POCT 面临复杂的监管环境,不同国家的监管要求差异较大,影响了新产品的上市速度和成本。制定标准化的全球监管指南,促进监管审批的协调统一,有助于加速 POCT 技术的全球推广。
在许多地区,基础设施限制,如电力供应不稳定、网络连接不佳和实验室设施不足等,阻碍了分子 POCT 的实施。可采用电池供电设备、改善移动连接等创新解决方案来克服这些障碍。
POCT 的广泛应用带来了可持续性和环境问题,如大量使用一次性消耗品导致生物医学废物增加。可通过开发可生物降解的消耗品或可重复使用的组件,以及采用循环经济原则,如产品回收计划等,减少对环境的影响。

八、技术发展展望

REASSURED 标准为分子 POCT 的发展提供了实践指导,但不同应用场景对各标准的侧重点可能不同,需要在检测设计中灵活权衡。在样本采集和存储方面,应注重采用无创或微创采样方法,并提供详细的操作说明,特别是针对家庭检测。核酸提取和纯化技术需根据样本类型进行优化,简化操作流程,提高效率和可靠性。核酸扩增技术中,PCR 虽成熟,但等温扩增技术具有快速便捷的优势,需进一步提高其性能,使其可靠性与 PCR 相当。在检测方法上,比色信号检测因用户友好、便于记录和传输结果,在现场和自我检测场景中有很大应用潜力,同时应推动检测结果的数字化和信息化集成。
目前,分子 POCT 的发展主要有两个方向:一是实现强大的 “样本进 - 结果出” 一体化系统,简化诊断流程;二是满足资源受限地区和家庭自我检测的需求,注重检测的可及性和可负担性。未来,需根据不同的应用场景,综合考虑成本效益、易用性、便携性和可扩展性等因素,开发最适合的解决方案。

九、结论

分子 POCT 技术在连接先进诊断和现场检测方面具有巨大潜力,能够改善医疗服务的可及性和有效性。通过持续创新和优化检测流程的关键步骤,分子 POCT 技术有望在各种应用场景中提升患者的治疗效果,实现及时干预。然而,要充分发挥其优势,需要研究人员、医疗服务提供者和政策制定者的共同努力。研究人员应不断改进 PCR 和等温扩增系统,开发创新的分析平台,探索可持续材料;医疗服务提供者应将 POCT 无缝集成到临床工作流程中,加强人员培训;政策制定者应营造支持性的监管环境,鼓励投资,建立质量控制和废物管理体系。各方协同合作,将加速分子 POCT 的应用,改善全球医疗服务水平,推动联合国可持续发展目标的实现。

下载安捷伦电子书《通过细胞代谢揭示新的药物靶点》探索如何通过代谢分析促进您的药物发现研究

10x Genomics新品Visium HD 开启单细胞分辨率的全转录组空间分析!

欢迎下载Twist《不断变化的CRISPR筛选格局》电子书

单细胞测序入门大讲堂 - 深入了解从第一个单细胞实验设计到数据质控与可视化解析

下载《细胞内蛋白质互作分析方法电子书》

相关新闻
    生物通微信公众号
    微信
    新浪微博

    今日动态 | 人才市场 | 新技术专栏 | 中国科学人 | 云展台 | BioHot | 云讲堂直播 | 会展中心 | 特价专栏 | 技术快讯 | 免费试用

    版权所有 生物通

    Copyright© eBiotrade.com, All Rights Reserved

    联系信箱:

    粤ICP备09063491号