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在生命科学研究中,细胞外蛋白质对于细胞间通讯和生理功能至关重要,但现有邻近标记(PL)方法在体内兼容性上存在局限。为解决此问题,研究人员开展了关于体内兼容的 PL 方法 TyroID 的研究,发现 TyroID 能高时空分辨率地绘制细胞外蛋白质组图谱,这为探究生物体内蛋白质定位和分子相互作用提供了有力工具。
在生命的微观世界里,细胞并非孤立存在,它们通过细胞外蛋白质进行着复杂而有序的 “交流”。这些细胞外蛋白质,就像细胞间的 “信使”,在细胞内信号传导和细胞间通讯中发挥着关键作用,几乎参与调控了多细胞生物的所有生理过程。不仅如此,许多 FDA 批准的药物也以细胞外蛋白质为靶点发挥作用。然而,想要深入了解这些 “信使” 的秘密并不容易。
目前,虽然在解析细胞外蛋白质组方面取得了一些进展,比如利用基于过氧化物酶和光催化剂的邻近标记(PL)技术,能够在一些模式生物中绘制细胞外蛋白质组图谱。但这些方法存在诸多限制,像是基于过氧化物酶的方法,因 H2O2具有细胞毒性,无法直接在活体动物中使用;而光催化剂由于可见光在生物体内穿透性有限,应用也受到阻碍。此外,现有的方法还可能受到背景干扰等问题的影响,使得在活体内全面分析细胞外蛋白质组变得困难重重。
为了突破这些困境,清华大学的研究人员展开了深入研究。他们致力于开发一种更高效、更安全的方法,来实现对细胞外蛋白质组的精准解析,从而更好地理解细胞间的相互作用机制,为疾病治疗和药物研发提供新的思路。经过不懈努力,研究人员成功开发出了 TyroID,这是一种体内兼容的 PL 技术,相关研究成果发表在《Nature Communications》上。
研究人员为开展此项研究,运用了多种关键技术方法。在蛋白质标记方面,利用酪氨酸酶(tyrosinase)催化酚探针生成具有高反应活性的邻醌(o -quinone)中间体,实现对蛋白质的标记;通过构建多种细胞模型和动物模型,如 MDA-MB-231 细胞模型、裸鼠荷瘤模型等进行实验;采用定量蛋白质组学技术,结合点击化学、质谱分析等手段,对标记的蛋白质进行鉴定和定量分析 。
研究结果如下:
- 体外验证酪氨酸酶标记蛋白质的能力:研究人员首先利用双孢蘑菇酪氨酸酶(abmTYR),通过与酚探针(如炔基酚(AP)和生物素酚(BP))反应,成功对牛血清白蛋白(BSA)进行标记,并通过多种实验方法,如凝胶内荧光扫描、液相色谱 - 串联质谱(LC-MS/MS)分析等,证实了 abmTYR 能够高效地催化邻醌中间体的形成,对蛋白质进行修饰,且修饰位点多位于蛋白质表面暴露区域12。
- 评估基因编码酪氨酸酶在活细胞中的标记效果:将 abmTYR 的催化亚基转染到 HEK293T 细胞中,发现其无法在哺乳动物细胞内有效发挥作用。转而研究来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium )的酪氨酸酶(BmTYR),虽然其体外标记效率低于 abmTYR,但在共处理 CuCl2和 AP 后,能够实现活细胞蛋白质组的标记。然而,研究发现 CuCl2的添加和 BmTYR 标记会严重破坏细胞生理,影响细胞活力,且标记的亚细胞特异性不足34。
- 建立 TyroID 用于细胞外蛋白质组标记:鉴于上述问题,研究人员利用重组酪氨酸酶进行细胞外蛋白质组标记。实验表明,abmTYR 与膜不可渗透的炔基酚探针(AxxP)共同处理细胞后,能够特异性地标记细胞表面蛋白质,且对细胞活力影响极小。通过定量蛋白质组学分析,鉴定出了大量细胞外蛋白质,并且发现 TyroID 标记不会显著干扰细胞内稳态56。
- 细胞选择性的细胞外蛋白质标记及 HER2 邻近蛋白质的分析:研究人员构建了针对人表皮生长因子受体 2(HER2)的靶向 TyroID 系统(ZHER-BmTYR),实现了对 HER2 阳性细胞表面蛋白质的特异性标记。通过定量蛋白质组学分析,鉴定出了 14 个 HER2 邻近蛋白质,这些蛋白质参与细胞 - 细胞粘附、成纤维细胞迁移调节等生物学过程,为深入了解 HER2 相关的生物学机制提供了新线索78。
- TyroID 在体内标记的应用:研究人员在活体小鼠中进行了三项实验。在肿瘤异种移植模型中,成功标记了 HER2 邻近蛋白质,且发现了一些在细胞培养实验中未识别的蛋白质;通过静脉注射 abmTYR 和 AxxP,实现了对血浆蛋白质的标记,并对其周转速率进行了量化分析;将 abmTYR 和 BP 注射到小鼠大脑海马体中,实现了海马体特异性的细胞外蛋白质组图谱绘制,且证明了 TyroID 标记在体内的低毒性910。
研究结论和讨论部分指出,TyroID 技术为在活体内标记内源性蛋白质提供了一种快速、无毒的方法,能够实现细胞外蛋白质组的时空解析图谱绘制。与现有 PL 方法相比,TyroID 具有更好的体内兼容性,为研究蛋白质定位和分子相互作用提供了强大的工具。不过,TyroID 也存在一定的局限性,例如无法进行细胞内标记,且标记过程可能会干扰蛋白质的定位和功能 。未来需要进一步优化该技术,开发更精确的探针来调控其标记半径,同时结合其他技术进行验证,以充分发挥其在生命科学研究中的潜力。总之,TyroID 技术的出现,为生命科学和健康医学领域的研究开辟了新的道路,有望推动相关领域取得更多重要突破。
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