《Applied and Environmental Microbiology》：Expanding the potential soil carbon sink: unraveling carbon sequestration accessory genes in vermicompost phages
编辑推荐：
本文通过宏基因组和宏病毒组测序，研究猪粪堆肥（SW）和蚯蚓堆肥（VE）对土壤微生物群落的影响。发现 VE 增加细菌多样性和碳固定能力，VE 土壤噬菌体携带更多碳固定辅助代谢基因（AMGs）。该研究为提升土壤碳汇提供新视角，值得关注。
### 引言
噬菌体广泛分布于土壤中，依据生活史可分为烈性噬菌体和温和噬菌体。烈性噬菌体裂解宿主细菌细胞完成繁殖周期，通过 “病毒分流” 促进碳矿化；温和噬菌体则随宿主一同复制且不裂解宿主细胞。噬菌体携带的辅助代谢基因（AMGs）能参与多种生理过程，在土壤碳循环中发挥着重要调控作用。土壤碳固存对于缓解全球气候变化意义重大，而有机肥料如蚯蚓堆肥和猪粪堆肥常被用于农业土壤，以调节土壤养分循环和碳循环。不过，不同堆肥对土壤中噬菌体携带碳相关 AMGs 的功能类型和代谢潜力的影响尚不明确。本研究假设蚯蚓堆肥中的噬菌体群落比猪粪堆肥能编码更多与碳固存相关的 AMGs，旨在通过宏基因组和宏病毒组测序分析，探究不同有机肥料处理土壤中细菌群落组成变化以及噬菌体携带 AMGs 的功能，进而剖析细菌和噬菌体对土壤碳循环的影响机制。
材料与方法
土壤采集 ：在江苏省南京市长期施用不同堆肥的农田采集土壤样本，包括未施肥的对照土壤（CK）、猪粪堆肥处理土壤和蚯蚓堆肥处理土壤，采集深度为 15 - 20cm，混合成复合样本后于 4°C 保存并带回实验室分析。土壤样本宏基因组分析 ：依据特定方法提取土壤 DNA 并进行宏基因组测序。具体步骤包括 DNA 提取、测序文库制备、全基因组鸟枪测序、数据质量控制、序列组装、开放阅读框预测、基因注释及功能基因分类等。噬菌体 DNA 提取和病毒组分析 ：采用特定方法提取土壤噬菌体 DNA 并进行病毒组分析。先富集游离噬菌体和诱导土壤原噬菌体，再提取总噬菌体 DNA，进行全噬菌体基因组扩增和测序，后续进行序列组装、噬菌体鉴定、相对丰度计算、噬菌体家族注释、生活方式预测及系统发育分析等。噬菌体 - 细菌关系分析 ：运用 CRISPR 间隔区匹配和基因组同源性匹配两种方法预测噬菌体与细菌序列的关联，确定噬菌体宿主范围，并对宿主细菌进行物种注释。噬菌体辅助代谢基因鉴定 ：利用 VIBRANT 和 DRAM - v 软件识别噬菌体编码的与碳循环及其他代谢功能相关的 AMGs，通过非度量多维缩放（NMDS）分析检测不同处理间 AMGs 的相似性差异，运用线性判别分析效应大小（LEfSe）方法检测差异显著的生物标志物 AMGs，并分析相关 AMGs 的蛋白质三级结构。噬菌体碳固存潜力计算 ：将宏基因组和病毒组读数分别比对到碳代谢相关的细菌基因和噬菌体 AMGs 上，计算基因覆盖率，进而计算噬菌体：总基因覆盖率比值，以此评估噬菌体 AMGs 对碳代谢的贡献，确定累积噬菌体碳固存潜力。数据统计分析 ：使用 GraphPad Prism 8.0 和 R（v.4.4.2）进行数据统计，利用相关工具进行数据可视化，通过 R 语言中的 vegan 和 ggplot2 包计算微生物群落的 α 和 β 多样性。
结果
土壤细菌群落概述 ：从不同处理土壤中回收了数量不等的细菌重叠群。CK 和 VE 土壤主要由变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和酸杆菌门（Acidobacteria）主导，SW 土壤中变形菌门占主导，其次是拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）。VE 增加了细菌群落多样性，但未改变群落均匀度和优势菌门；SW 则降低了细菌群落的均匀度和多样性，并改变了优势菌门。在功能基因方面，不同处理间存在差异，SW 改变了土壤细菌群落碳代谢酶的组成和丰度，而 VE 与 CK 的碳代谢酶组成和丰度相似。土壤噬菌体群落概述 ：通过宏病毒组分析获得不同处理土壤的噬菌体重叠群，发现本研究中的噬菌体与 RefSeq 数据库共享的病毒簇较少。SW 和 VE 处理未改变噬菌体群落的 α 多样性，但影响了优势噬菌体家族和群落结构。对照和堆肥土壤中假定的噬菌体 - 宿主联系 ：通过两种方法分析噬菌体与细菌的相互作用，发现共 69 个噬菌体重叠群与 447 个细菌重叠群相关联，涉及 44 种已知细菌分类群。不同处理中感染宿主细菌的优势噬菌体不同，SW 土壤中广义噬菌体和狭义噬菌体的相对丰度均高于 CK 和 VE 土壤。噬菌体编码的参与碳固存的 AMGs ：在三个处理中鉴定出 75 个编码 102 个 AMGs 的噬菌体重叠群，VE 土壤中独特的编码 AMGs 的噬菌体重叠群更多。不同处理间噬菌体 AMGs 的组成存在差异，VE 土壤中的碳代谢相关 AMGs 主要参与碳固存，而 CK 和 SW 土壤分别主要参与碳转化和碳分解。LEfSe 富集分析表明，VE 土壤中与碳固存相关的 AMGs（如GT6 、GT11 ）显著富集，且这些基因具有表达潜力。土壤中噬菌体 AMGs 的碳固存潜力 ：计算不同处理土壤中噬菌体 AMGs 的碳固存潜力，发现 VE 土壤中噬菌体 AMGs 的碳固存潜力最高，其中GT11 和GT6 是 VE 和 CK 土壤中碳固存的主要驱动因素，表明它们在促进宿主细菌碳固存方面具有较高潜力。
讨论
蚯蚓堆肥应用增加了土壤细菌群落的碳固存能力 ：蚯蚓堆肥应用提高了土壤中碳固存基因的相对丰度，其中参与还原三羧酸循环的关键基因oorA 在蚯蚓堆肥土壤中最为丰富。这可能是因为蚯蚓肠道中的厌氧细菌迁移到土壤环境中，增强了土壤细菌对 CO2 的固定能力。此外，蚯蚓堆肥增加了细菌群落的丰富度，促进了对多种碳底物的利用，提高了碳利用效率（CUE），进而间接促进了土壤碳固存。较少的烈性噬菌体减少了蚯蚓堆肥土壤中细菌的碳周转 ：烈性噬菌体的裂解感染会影响土壤养分周转。研究发现，猪粪堆肥增加了土壤中烈性噬菌体的比例，而蚯蚓堆肥则降低了其比例。这导致蚯蚓堆肥土壤中因宿主细菌裂解而释放到环境中的有机物质减少，可能降低了土壤宿主细菌有机碳的周转。不过，烈性噬菌体对土壤碳损失和固存的影响仍有待进一步研究，同时土壤 RNA 病毒在土壤碳循环中的作用也需加强研究。噬菌体编码的 AMGs 在土壤碳固存中的潜在作用 ：噬菌体编码的 AMGs（如GT6 和GT11 ）在蚯蚓堆肥土壤中富集，它们参与了细菌细胞膜中糖鞘脂的生物合成，将小分子乳糖基神经酰胺转化为更难降解的大分子糖鞘脂，从而促进微生物细胞的碳固存。蚯蚓堆肥土壤中噬菌体 AMGs 的碳固存潜力更高，为宿主细菌提供了新的碳固定途径。但由于本研究采用短读长测序技术，难以准确追踪碳固存与特定噬菌体物种的关系，未来可结合长读长测序技术深入研究。
结论
本研究通过宏基因组和宏病毒组测序分析，发现蚯蚓堆肥和猪粪堆肥在土壤碳循环过程中作用不同。蚯蚓堆肥增加了细菌多样性，富集了与碳固存相关的噬菌体编码 AMGs，提高了土壤碳固存能力；猪粪堆肥则降低了细菌多样性，其噬菌体 AMGs 更多与碳分解相关，降低了碳固存潜力。蚯蚓堆肥土壤中富集的GT6 和GT11 在协助宿主细菌碳固存方面具有重要作用，为促进土壤碳固存和缓解气候变化提供了新途径。
打赏
下载安捷伦电子书《通过细胞代谢揭示新的药物靶点》探索如何通过代谢分析促进您的药物发现研究
10x Genomics新品Visium HD 开启单细胞分辨率的全转录组空间分析！
欢迎下载Twist《不断变化的CRISPR筛选格局》电子书
单细胞测序入门大讲堂 - 深入了解从第一个单细胞实验设计到数据质控与可视化解析
下载《细胞内蛋白质互作分析方法电子书》
