《Applied and Environmental Microbiology》：Broiler litter moisture and trace metals contribute to the persistence of Salmonella strains that harbor large plasmids carrying siderophores
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本文研究肉鸡垫料中沙门氏菌（Salmonella）生态。通过对两个商业肉鸡舍垫料采样分析，发现垫料湿度和微量金属影响 Salmonella 的存活，携带铁载体大质粒的菌株占主导。该研究为控制 Salmonella 提供新视角，对保障禽肉安全意义重大。
### 研究背景
沙门氏菌（Salmonella）感染常与家禽消费相关。尽管美国实施关键绩效指标后，收获后鸡肉样本中 Salmonella 检测阳性数减少，但沙门氏菌病总体发病率未变。美国食品安全检验局（FSIS）提出在收获前控制 Salmonella 负荷的监管框架，但目前缺乏准确测定鸡胴体或环境基质中 Salmonella 负荷的方法。肉鸡垫料采样是检测 Salmonella 感染鸡群的实用方法，研究 Salmonella 在垫料中的生态学，对了解其传播和控制具有重要意义。
材料和方法
研究设计 ：在 2021 年 5 月至 2022 年 3 月期间，于两个相邻的商业肉鸡舍中连续饲养四批肉鸡，使用回收垫料作为 bedding material，在批次间进行机械清理和施用铝硫酸盐（alum）处理。垫料采样 ：在鸡生长的不同阶段（4 - 14 天和 32 - 38 天）及批次间的停机期（alum 施用前后）采集垫料样本，每个鸡舍分多个区域采样，共获得 224 个 pooled litter samples。垫料处理与 Salmonella 分离 ：采用选择性培养富集技术从垫料样本中分离 Salmonella，通过一系列培养步骤，将疑似菌落接种到不同培养基上，最终保存 Salmonella 阳性样本中的菌株。定量 PCR 测定 Salmonella 丰度 ：提取垫料样本 DNA，利用定量 PCR（qPCR）检测总肠杆菌科（以 gapA 为靶基因）、Salmonella enterica（以 ttrBCD 为靶基因）和 S. Infantis（以 usg 为靶基因）的基因拷贝数，计算 Salmonella 相对丰度。Salmonella 分离株的药敏试验和血清分型 ：采用肉汤微量稀释法测定 Salmonella 分离株对抗生素的敏感性，将菌株送实验室进行血清分型。Salmonella 分离株的全基因组测序和生物信息学分析 ：对部分 Salmonella 分离株进行长读长和短读长测序，使用多种工具进行基因组注释、抗性基因和毒力因子鉴定，并构建系统发育树。垫料 pH、湿度和营养成分测定 ：通过烘干法测定垫料湿度，用 pH 计测量垫料洗脱液 pH，采用特定方法分析垫料中的营养成分。使用机器学习模型预测 Salmonella 检测结果 ：选择七种机器学习分类器，以垫料细菌和理化参数为特征，进行数据预处理、超参数调整、模型比较评估和特征重要性分析，构建预测 Salmonella 存在与否的模型。铁限制和铜富集条件下的生长实验 ：选取八种 Salmonella 菌株，在不同培养基（LB、LB 添加酸化 CuSO4 、LB 添加铁螯合剂和酸化 CuSO4 、LB 添加铁螯合剂）中培养，测定菌株生长情况。在病原体检测数据库中鉴定 SNP 簇 ：搜索 NCBI 病原体检测数据库（GenomeTrakr），获取与研究中 Typhimurium 分离株相关的 SNP 簇元数据和基因组组装文件。统计分析 ：对数据进行 log10 转换后，使用多种统计方法（Fisher 精确检验、Mann - Whitney 检验、Kruskal - Wallis 检验、Spearman 相关检验、简单逻辑回归等）分析差异和相关性。
结果
垫料中 Salmonella 的流行率和丰度 ：总体上，垫料样本中 Salmonella 流行率为 48.6%，鸡群存在时（grow - out）流行率（76%）显著高于停机期（12.5%）。Salmonella 丰度在不同批次和 grow - out 与停机期之间存在显著差异，且与鸡群年龄无关。Salmonella 血清型和抗生素抗性谱 ：分离株分为九种血清型，Typhimurium、Kentucky 和 Infantis 占多数。不同鸡舍血清型分布存在显著差异，Infantis 和 Typhimurium 分离株表现出不同的抗生素抗性模式。Salmonella 分离株的基因组多样性 ：测序结果显示，Infantis、Typhimurium 和 Kentucky 分离株分别属于不同的多位点序列类型（MLSTs）和核心基因组 MLST（cgST），各血清型分离株间单核苷酸多态性（SNP）差异不同。Salmonella 基因组中的抗菌抗性决定因素 ：Infantis 分离株携带较多抗菌抗性基因（ARGs），位于大质粒 IncFIB (pN55391) 上；Typhimurium 和 Kentucky 分离株的 ARGs 分别位于 IncC 和 IncH12A 等质粒上。Salmonella 基因组中可传播适应性因子的遗传背景 ：三种血清型均含有多种毒力基因（VGs），Infantis 和 Typhimurium 携带编码 yersiniabactin 的 VGs，Kentucky 携带编码 aerobactin 的 VGs，相关基因位于不同质粒上。使用机器学习预测 Salmonella ：决策树分类器在预测 Salmonella 培养阳性或阴性方面最有效，垫料结块部分的湿度、ttr/gapA 比值和 gapA 丰度是影响模型预测的主要变量。垫料湿度与营养成分的相关性 ：垫料湿度与磷、铁和铜浓度相关，湿度增加时，铁浓度降低，磷和铜浓度升高。低铁水平的垫料样本更易检测到 Salmonella。铁和铜暴露对 Salmonella 适应性的影响 ：在铁限制和铜富集条件下，不同 Salmonella 菌株生长表现不同，Typhimurium 菌株在某些条件下生长较好，表明微量营养素影响菌株生长。从鸡肉样本中分离的 Typhimurium 基因组中携带 Ybt 的 IncC 质粒的存在 ：在 NCBI 数据库中搜索发现，来自鸡肉样本的 Typhimurium 基因组中，携带 Ybt 的 IncC 质粒较为常见。
讨论
检测方法的优势与局限 ：qPCR 方法可有效测定 Salmonella 基因丰度，但仅靠基因丰度不能确定样本是否培养阳性。将基因丰度纳入机器学习模型可提高预测准确性。血清型和基因特征 ：研究中发现的主要血清型与其他研究一致，不同血清型在不同批次中的分布差异可能与多种因素有关，如竞争、疫苗接种或鸡群来源。抗性基因和毒力因子 ：Typhimurium 和 Infantis 的某些特征表明，相关抗性基因和毒力因子可能在其生存和传播中起重要作用，如 IncC 质粒上的 Ybt 编码基因。垫料湿度的影响 ：垫料湿度是影响 Salmonella 在垫料中生存的关键因素，较高湿度增加了检测到可培养 Salmonella 的可能性，可能通过影响营养成分的生物利用度来实现。
结论
本研究表明 Salmonella 在肉鸡垫料中持续存在，Typhimurium 和 Infantis 是主要血清型。铁和铜影响携带大共轭质粒的菌株生长，垫料湿度是预测可培养 Salmonella 存在的重要因素，为农场监测 Salmonella 提供了有前景的预测模型。但研究存在样本量小和菌株选择有偏差等局限性，未来需更大数据集进行验证。
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