《Communications Biology》：Microtubules as a versatile reference standard for expansion microscopy
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在扩张显微镜（ExM）技术不断发展的当下，因缺乏统一的验证结构，研究人员开展了以微管作为 ExM 验证结构的研究。结果表明微管可有效用于 ExM 技术验证，为该技术发展提供了关键参考，推动相关研究迈向新高度。
在微观的细胞世界里，科学家们一直渴望能看得更清楚、更精确，超分辨率荧光显微镜的出现，就像是给他们配备了 “超级放大镜”，让分子和细胞器的观察精度逼近电子显微镜领域。但在这个探索微观世界的过程中，遇到了不少难题。传统的衍射极限成像存在一个 “顽固” 的问题，那就是紧密相邻的荧光团会同时发射荧光，导致成像模糊。为了解决这个问题，科学家们各显神通，开发出了多种超分辨率技术，像受激发射损耗显微镜（STED）、饱和结构光照明显微镜（SIM）和单分子定位显微镜（SMLM）等，它们从不同角度解决了荧光团同时发射荧光的问题。
扩张显微镜（ExM）则另辟蹊径，它通过将样本嵌入可膨胀凝胶中并使其膨胀，从而增加荧光团之间的间距，达到高分辨率成像的目的。然而，这项技术在发展过程中面临一个关键挑战 —— 缺乏统一认可的验证结构。核孔复合体（NPC）和 DNA 纳米标尺虽然在其他显微镜技术中表现出色，但在 ExM 中却存在诸多问题。NPC 由于其蛋白质致密的特性，在样本固定后，组件相互连接紧密，在膨胀过程中难以分离，即便采取蛋白质酶 K 消化等方法，也会导致标记质量下降或膨胀系数不理想；DNA 纳米标尺因与蛋白质连接到 ExM 凝胶的化学方式不同，作为 ExM 验证结构存在固有局限。在这样的背景下，研究人员迫切需要寻找一种可靠的结构来验证 ExM 技术，微管成为了备受关注的 “潜力股”。
德国哥廷根大学医学中心神经与感觉生理学系等机构的研究人员，开展了以微管作为 ExM 验证结构的研究。研究发现，微管可以作为 ExM 的纳米标尺，不同的处理方式能使其适用于不同分辨率的 ExM 技术验证，为 ExM 技术的发展和完善提供了重要依据。该研究成果发表在《Communications Biology》杂志上。
为开展此项研究，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先是免疫染色技术，使用针对 α - 微管蛋白的单克隆和多克隆抗体及相应的二抗对微管进行标记，通过共聚焦显微镜、STED 显微镜等观察微管的形态和大小；其次采用洗涤剂提取结合 NHS - ester 化学标记的方法，去除细胞内其他蛋白干扰，直接标记微管；此外，还在体外组装微管，优化固定和锚定条件，使其适用于 ExM 分析。
研究结果如下：
- 传统免疫染色中的微管分析：研究人员运用 X10 ExM 技术，对 HeLa 培养细胞中的微管用四种不同的抗 α - 微管蛋白抗体进行免疫染色，再结合二抗标记。结果显示，标记效果良好，通过共聚焦显微镜和 STED 显微镜成像，观察到的微管大小与预期相符。使用一步纳米级扩张（ONE）显微镜协议结合超分辨率径向涨落（SRRF）软件，进一步提高了分辨率，能够区分不同抗体的荧光信号。
- 通过洗涤剂提取直接分析微管：为提升标记准确性、降低连接误差，研究人员采用 NHS - ester 化学直接标记微管。他们先对细胞进行洗涤剂提取处理，去除膜成分和细胞质蛋白，再用 NHS - ester 荧光素标记。结果表明，这种方法能有效标记微管，成像分辨率可达 7.6 ± 0.1633nm，通过 ONE 显微镜观察，微管形态与预期相符，且能与其他细胞骨架成分区分开来。
- 体外无细胞环境下的微管分析：体外制备微管理论上能获得更高的精度，但微管在体外不稳定，容易解聚。研究人员测试了多种化学固定方案，发现 8% 的多聚甲醛（PFA）能在一定程度上平衡固定和锚定的需求。经固定、锚定、凝胶化和 NHS - ester 标记后，虽然微管存在部分解聚导致的结构损伤，但仍可识别，且其轮廓平均尺寸与预期相符，同时还意外获得了大量游离的微管蛋白二聚体。
研究结论和讨论部分指出，微管可通过 ExM 方法在细胞内和体外高效成像。在较低分辨率下，免疫染色的微管虽能呈现连续标记，但高分辨率下荧光信号稀疏，表明微管蛋白表位覆盖不足；NHS - ester 化学直接标记微管可降低连接误差，但存在微管部分解聚的问题，而洗涤剂提取法解决了这一问题，是将微管用作纳米标尺的最简单可靠的方法。与 DNA 纳米标尺相比，微管作为天然细胞成分，更适合用于 ExM 技术验证。这项研究不仅为 ExM 技术的验证提供了切实可行的方案，也为深入研究微管结构以及细胞内罕见事件，如微管腔内肌动蛋白丝的存在等，开辟了新的途径，对推动细胞生物学研究和相关技术发展具有重要意义 。
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