### 引言
清水湖是北美最古老的湖泊之一，也是加利福尼亚州最大的天然湖泊。它是一个自然富营养化湖泊，人类活动加剧了其富营养化程度，导致蓝藻水华频繁发生。蓝藻水华产生的毒素对人类和野生动物构成严重威胁，而传统研究方法存在局限性，因此本研究采用核糖体 RNA 基因测序技术，深入探究清水湖浮游细菌和真核微生物群落的物种丰富度、群落组成、时空动态以及环境因素和蓝藻水华对群落结构的影响。

材料与方法

1. 研究地点和采样方案：在清水湖多个采样点进行采样，以研究微生物群落的年际和月度变化。分别在 2019 - 2021 年的 8 月采集样本用于年际变化研究，在 2021 年的 7 - 10 月采集样本用于月度变化研究，采样点涵盖湖泊的三个主要区域及两个连接区域。
2. 样本采集：使用清洁的酸洗聚碳酸酯水瓶采集表层水样，用于核酸提取、营养分析、叶绿素 a 和微囊藻毒素检测。同时使用特定仪器收集水体的理化参数，利用浮游生物网收集样本用于显微镜分析。
3. 微囊藻毒素、叶绿素 a 和营养分析：采用 ADDA ELISA 试剂盒测定总微囊藻毒素浓度，用荧光法测定叶绿素 a 浓度，使用比色法测定总磷和总氮浓度。
4. DNA 分离和测序：从过滤器上提取 DNA，使用特定引物构建 16S 和 18S rRNA 基因扩增子文库，在 Illumina Miseq 平台上进行测序。
5. 序列分析：根据特定的分析流程对 16S/18S 扩增子序列进行分析，将序列分类为原核生物（16S rRNA）和真核生物（18S rRNA），去除污染和低丰度序列，进行归一化处理后在 R 语言中进行数据分析。
6. 统计检验：使用 R 语言中的相关包进行贝塔多样性计算、PERMANOVA 分析、主坐标分析（PCoA）、冗余分析（RDA）和 Spearman 相关分析等。

结果

1. 清水湖蓝藻水华相关的理化条件：微囊藻毒素浓度在近年来常达到较高水平，在不同年份、月份和采样点存在显著差异，其中 Oaks 和 Lower Arms 区域问题较为突出。叶绿素 a 浓度也呈现出季节性、年际和空间变化，与微囊藻毒素浓度呈正相关。其他环境变量如总氮、总磷和电导率等同样存在时空变化。
2. 清水湖细菌群落组成和多样性：共检测到 4713 个细菌扩增子序列变体（ASVs），蓝藻在细菌群落中占主导地位，且群落组成存在季节性和年际变化。2021 年夏季和秋季样本存在一个由 629 个 ASVs 组成的 “核心” 细菌群落，不同年份 8 月样本中优势细菌门类相似但存在差异，同一日期不同采样点的细菌群落组成也有明显差异。
3. 清水湖真核生物群落组成和多样性：去除稀有和污染 ASVs 后，清水湖真核生物群落由 652 个独特 ASVs 组成。与细菌群落不同，2021 年四个月度样本中只有 36 个真核生物 ASVs 共享，优势真核生物类群随月份变化而变化。在年际调查中，三年 8 月样本的 “核心” 真核生物群落由 64 个 ASVs 组成，不同年份真核生物类群比例存在差异。
4. 清水湖微生物群落的季节和空间差异：主坐标分析显示，细菌群落和真核生物群落的组成在 2021 年存在明显的季节性变化。细菌群落中，不同蓝藻属在不同月份占主导地位，且 Lower Arm 区域样本在夏季和秋季聚类紧密，可能与微囊藻水华有关。真核生物群落中，光合类群在不同季节的优势度发生变化，异养生物如纤毛虫和后生动物也在群落中占重要比例，且后生动物在某些区域有偏好。
5. 清水湖微生物群落的年际和空间差异：年际和空间分析表明，2019 年 8 月的细菌群落与 2020 年、2021 年差异较大，而真核生物群落则呈现出明显的年际分离。不同年份各区域的蓝藻和真核生物优势类群不同，微囊藻毒素浓度在 2021 年 8 月最高。
6. 环境因素对清水湖微生物群落动态的影响：PERMANOVA 分析表明，微囊藻毒素浓度、叶绿素 a 浓度、总磷、溶解氧浓度和电导率等环境因素对细菌和真核生物群落的年际和月度变化有显著影响。RDA 和 Spearman 相关分析进一步揭示了环境变量与特定分类群丰度趋势的关系，不同蓝藻和真核生物类群与环境变量的相关性各异。

讨论

1. 微生物群落分析的环境和藻华背景：清水湖的营养物质和其他理化参数的年际和月度变化导致藻华的分类组成和毒性发生变化。2021 年是毒性较强的一年，总氮和总磷浓度较高可能促进了有毒蓝藻水华的发生。湖内不同区域藻华强度和群落组成存在空间差异，微囊藻毒素和叶绿素 a 浓度的相关性较弱，表明不能仅通过叶绿素 a 浓度预测毒素水平。
2. 清水湖核心群落以光合类群为主：分子调查显示，清水湖细菌群落以蓝藻为主，真核生物群落中光合类群也占主导地位，这与湖内较高的叶绿素 a 水平和初级生产力相符。
3. 蓝细菌属 Cyanobium 是清水湖蓝藻群落的重要成员：微小的蓝细菌属 Cyanobium 在清水湖西部夏季较为丰富，与非水华条件相关，其丰度与微囊藻毒素水平呈负相关，可能在低营养条件下具有竞争优势。而通过显微镜能观察到的 Gloeotrichia，在测序数据中未被检测到，这凸显了多种研究方法结合的重要性。
4. 清水湖蓝藻群落呈现固氮和非固氮水华类群的季节性演替：固氮蓝藻是清水湖细菌群落的重要组成部分，促进了其他非固氮蓝藻和真核生物的增殖。研究观察到不同固氮和非固氮蓝藻的时间演替，微囊藻水华的出现与总氮增加有关，且湖内 TN:TP 值的变化支持了固氮蓝藻先占优势，后被非固氮蓝藻取代的现象。
5. 磷在塑造整体微生物群落组成中仍起主要作用：2021 年夏季和秋季采样期间，微生物群落组成发生显著月度变化，PERMANOVA 和 RDA 分析表明磷是解释细菌和真核生物群落月度 / 季节变化的最重要变量，其次是温度，磷的增加促进了不同蓝藻类群的演替。
6. 共生细菌和真核生物群落也呈现季节性趋势：蓝藻与环境中的生物和非生物成分持续相互作用，共生细菌通过调节营养限制影响蓝藻水华的发展，蓝藻水华强度也会改变共生细菌和真核生物群落的组成和多样性。清水湖细菌群落中，hgcI clade 和 CL500 - 29 两个属呈现相反的季节性趋势，可能与不同蓝藻物种形成的水华有关。真核生物群落也存在月度演替，但速度比细菌群落慢，部分真核生物类群与微囊藻毒素浓度的相关性与预期不同。
7. 清水湖微生物群落表现出强烈的年际变化：对清水湖 8 月微生物群落的多年分析表明，细菌和真核生物群落均存在年际变化，细菌群落的年际差异主要由蓝藻群落的差异驱动，真核生物群落的年际变化主要由光合类群的变化引起。
8. 蓝藻群落的空间趋势影响共生真核生物群落，并与清水湖微囊藻毒素分布相对应：清水湖微生物群落存在明显的空间趋势，Oaks Arm 和 Lower Arm 区域的微生物群落组成更为相似，微囊藻在这些区域更为集中，且与微囊藻毒素浓度呈强正相关。蓝藻水华的差异可能影响真核生物群落的组成，如某些后生动物和微藻与微囊藻的分布存在关联，推测蓝藻属的空间分布可能通过物理和化感作用影响真核生物群落的分布。