铁依赖的铜抗性机制：新月柄杆菌中 TonB 依赖受体（TBDR）与加氧酶的关键作用

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《Journal of Bacteriology》：Role of a TonB-dependent receptor and an oxygenase in iron-dependent copper resistance in Caulobacter crescentus

【字体：大中小】 时间：2025年03月29日 来源：Journal of Bacteriology 2.7

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　　本文聚焦新月柄杆菌（Caulobacter crescentus），探究 Fe 转运相关的 TonB 依赖受体（TBDR）CciT 及其伙伴 2 - 氧戊二酸 / Fe²⁺依赖加氧酶 CciO 在铜抗性中的作用。研究发现环境铁水平影响细胞内铁、铜含量，CciT 和 CciO 协同维持铁稳态以抵抗铜胁迫，为理解细菌金属抗性机制提供新视角。

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　　### 引言
铜（Cu）是许多生物体必需的金属辅因子，参与特定氧化还原酶的活动，但高浓度的铜具有毒性。在革兰氏阴性菌中，外膜 TonB 依赖受体（TBDRs）对摄取细胞外 Fe³⁺

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至关重要。此前研究表明，环境会调节新月柄杆菌（Caulobacter crescentus）对铜的反应。本研究旨在探究参与铁转运的 TBDR 及相关加氧酶在新月柄杆菌铜抗性中的作用，强调铁稳态对铜抗性的重要性，以及金属调节系统间相互作用在细菌金属抗性中的意义。

结果

CciT 对铜抗性的关键作用：通过对新月柄杆菌 mini-Tn5 转座子突变文库的遗传筛选，发现 CCNA_00028 基因（即 cciT）与铜敏感性相关。构建 ΔcciT 突变体，在富营养（PYE）和贫营养（M2G）培养基中添加适量 CuSO₄时，该突变体生长受抑制，而异源表达 cciT 可恢复野生型表型，表明 CciT 在铜抗性中起关键作用，且铜敏感性并非极性效应导致。
CciT 与金属稳态的关系：测量细胞内铜含量发现，ΔcciT 突变体的铜敏感性并非由铜积累增加引起。同时，研究 CciT 对其他金属胁迫的抗性，发现 cciT 缺失不影响对镉、铁、锰、镍和锌的抗性，说明 CciT 专门用于抵抗铜胁迫。此外，CciT 参与铁摄取，ΔcciT 突变体铁含量与野生型相似，过表达 cciT 则增加铁积累。在缺铁固体培养基上，ΔcciT 突变体生长缺陷，补充铁或回补 cciT 基因可恢复正常生长，表明 CciT 在铁摄取中起作用。
铁浓度与铜抗性的关联：监测野生型菌株在不同铁浓度下的铜敏感性，发现环境铁浓度与铜耐受性相关，高铁浓度可降低细胞内铜含量。通过蛋白质组学分析，发现高铁条件下铜仍能进入细胞并触发铜胁迫反应，推测可能存在未知的铜外排系统。
CciO 与 CciT 的关系及功能：cciT 与预测编码 2 - 氧戊二酸 / Fe²⁺依赖加氧酶（2OGX）的 cciO 基因位于同一操纵子，该操纵子在多种细菌中保守。构建 ΔcciO、Δoperon 突变体，其铜敏感性与 ΔcciT 突变体相似，回补相应基因可恢复野生型表型。构建 CciT 和 CciO 的点突变体，发现二者的存在和活性对完全抵抗铜胁迫均很重要，暗示它们之间存在功能联系。在缺铁条件下，ΔcciO 和 Δoperon 突变体在固体培养基上生长缺陷，与 ΔcciT 突变体表现相似。测量细胞内铜和铁水平发现，CciO 不参与铜和铁的转运。
CciT 和 CciO 对细胞蛋白质组的影响：通过非靶向蛋白质组学分析，发现 ΔcciT 和 ΔcciO 突变体中 CciT 和 CciO 的蛋白质水平降低，但 mRNA 水平不变。同时，两种突变体中 Fe-importing TBDRs 和 FeoB 蛋白的丰度也下降，尽管细胞内铁水平未改变。

讨论

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本研究强调了 CciT 和 CciO 在新月柄杆菌铜抗性中的重要作用。CciT 作为铁转运的 TBDR，在铜抗性中发挥独特作用，通过防止细胞内铜积累来抵抗铜胁迫。环境铁浓度影响细胞内铁含量，进而影响铜抗性，充足的铁稳态可补偿铜诱导的金属错配，增强对铜的抗性。虽然 CciO 在铜抗性中的具体作用尚待阐明，但它与 CciT 可能存在协同作用，如 CciO 可能代谢 CciT 转运的底物，或利用 CciT 转运的铁离子作为辅因子发挥功能，进而赋予细菌铜抗性。本研究揭示了细菌应对铜胁迫时环境条件的重要性，强调研究细菌生理过程需考虑其环境复杂性。

材料和方法

细菌菌株、质粒和生长条件：新月柄杆菌 NA1000 在 30°C、适度振荡条件下，于 PYE 富营养培养基或 M2G 矿物培养基中培养，根据实验需求添加抗生素和 CuSO₄·5H₂O 等。
生长曲线测量：将处于指数生长期的细菌稀释后接种到 96 孔板，添加相应金属离子，在 Epoch 2 吸光读数仪中于 30°C 连续振荡培养，每 10 分钟记录一次 OD_660nm，持续 24 小时。
活力测定：将过夜培养的静止期菌液进行 10 倍系列稀释，取 5 μL 稀释液点在含有相应浓度 CuSO₄和 / 或 FeSO₄的 PYE 或 M2G 平板上，30°C 培养 48 小时后拍照。
金属含量测定：固定、洗涤指数生长期的细菌，裂解后用 ICP-OES 测定细胞内金属含量，根据细菌数量计算细胞内金属浓度。
LC-MS（液相色谱 - 质谱联用）：分离、洗涤细菌细胞，裂解后处理样品进行 LC-MS 分析，包括蛋白质消化、色谱分离和质谱检测，使用特定软件进行数据处理和蛋白质鉴定。
RT-qPCR（逆转录定量聚合酶链式反应）：培养细菌，处理后提取 RNA，经 DNA 酶处理、逆转录得到 cDNA，进行 qPCR 反应，以 mreB 基因为内参，用 2^???Ct方法计算基因相对表达量。