《Journal of Bacteriology》:Role of a TonB-dependent receptor and an oxygenase in iron-dependent copper resistance in Caulobacter crescentus
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本文聚焦新月柄杆菌(Caulobacter crescentus),探究 Fe 转运相关的 TonB 依赖受体(TBDR)CciT 及其伙伴 2 - 氧戊二酸 / Fe2+依赖加氧酶 CciO 在铜抗性中的作用。研究发现环境铁水平影响细胞内铁、铜含量,CciT 和 CciO 协同维持铁稳态以抵抗铜胁迫,为理解细菌金属抗性机制提供新视角。
### 引言
铜(Cu)是许多生物体必需的金属辅因子,参与特定氧化还原酶的活动,但高浓度的铜具有毒性。在革兰氏阴性菌中,外膜 TonB 依赖受体(TBDRs)对摄取细胞外 Fe
3+至关重要。此前研究表明,环境会调节新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)对铜的反应。本研究旨在探究参与铁转运的 TBDR 及相关加氧酶在新月柄杆菌铜抗性中的作用,强调铁稳态对铜抗性的重要性,以及金属调节系统间相互作用在细菌金属抗性中的意义。
结果
- CciT 对铜抗性的关键作用:通过对新月柄杆菌 mini-Tn5 转座子突变文库的遗传筛选,发现 CCNA_00028 基因(即 cciT)与铜敏感性相关。构建 ΔcciT 突变体,在富营养(PYE)和贫营养(M2G)培养基中添加适量 CuSO4时,该突变体生长受抑制,而异源表达 cciT 可恢复野生型表型,表明 CciT 在铜抗性中起关键作用,且铜敏感性并非极性效应导致。
- CciT 与金属稳态的关系:测量细胞内铜含量发现,ΔcciT 突变体的铜敏感性并非由铜积累增加引起。同时,研究 CciT 对其他金属胁迫的抗性,发现 cciT 缺失不影响对镉、铁、锰、镍和锌的抗性,说明 CciT 专门用于抵抗铜胁迫。此外,CciT 参与铁摄取,ΔcciT 突变体铁含量与野生型相似,过表达 cciT 则增加铁积累。在缺铁固体培养基上,ΔcciT 突变体生长缺陷,补充铁或回补 cciT 基因可恢复正常生长,表明 CciT 在铁摄取中起作用。
- 铁浓度与铜抗性的关联:监测野生型菌株在不同铁浓度下的铜敏感性,发现环境铁浓度与铜耐受性相关,高铁浓度可降低细胞内铜含量。通过蛋白质组学分析,发现高铁条件下铜仍能进入细胞并触发铜胁迫反应,推测可能存在未知的铜外排系统。
- CciO 与 CciT 的关系及功能:cciT 与预测编码 2 - 氧戊二酸 / Fe2+依赖加氧酶(2OGX)的 cciO 基因位于同一操纵子,该操纵子在多种细菌中保守。构建 ΔcciO、Δoperon 突变体,其铜敏感性与 ΔcciT 突变体相似,回补相应基因可恢复野生型表型。构建 CciT 和 CciO 的点突变体,发现二者的存在和活性对完全抵抗铜胁迫均很重要,暗示它们之间存在功能联系。在缺铁条件下,ΔcciO 和 Δoperon 突变体在固体培养基上生长缺陷,与 ΔcciT 突变体表现相似。测量细胞内铜和铁水平发现,CciO 不参与铜和铁的转运。
- CciT 和 CciO 对细胞蛋白质组的影响:通过非靶向蛋白质组学分析,发现 ΔcciT 和 ΔcciO 突变体中 CciT 和 CciO 的蛋白质水平降低,但 mRNA 水平不变。同时,两种突变体中 Fe-importing TBDRs 和 FeoB 蛋白的丰度也下降,尽管细胞内铁水平未改变。
讨论
本研究强调了 CciT 和 CciO 在新月柄杆菌铜抗性中的重要作用。CciT 作为铁转运的 TBDR,在铜抗性中发挥独特作用,通过防止细胞内铜积累来抵抗铜胁迫。环境铁浓度影响细胞内铁含量,进而影响铜抗性,充足的铁稳态可补偿铜诱导的金属错配,增强对铜的抗性。虽然 CciO 在铜抗性中的具体作用尚待阐明,但它与 CciT 可能存在协同作用,如 CciO 可能代谢 CciT 转运的底物,或利用 CciT 转运的铁离子作为辅因子发挥功能,进而赋予细菌铜抗性。本研究揭示了细菌应对铜胁迫时环境条件的重要性,强调研究细菌生理过程需考虑其环境复杂性。
材料和方法
- 细菌菌株、质粒和生长条件:新月柄杆菌 NA1000 在 30°C、适度振荡条件下,于 PYE 富营养培养基或 M2G 矿物培养基中培养,根据实验需求添加抗生素和 CuSO4·5H2O 等。
- 生长曲线测量:将处于指数生长期的细菌稀释后接种到 96 孔板,添加相应金属离子,在 Epoch 2 吸光读数仪中于 30°C 连续振荡培养,每 10 分钟记录一次 OD660nm,持续 24 小时。
- 活力测定:将过夜培养的静止期菌液进行 10 倍系列稀释,取 5 μL 稀释液点在含有相应浓度 CuSO4和 / 或 FeSO4的 PYE 或 M2G 平板上,30°C 培养 48 小时后拍照。
- 金属含量测定:固定、洗涤指数生长期的细菌,裂解后用 ICP-OES 测定细胞内金属含量,根据细菌数量计算细胞内金属浓度。
- LC-MS(液相色谱 - 质谱联用):分离、洗涤细菌细胞,裂解后处理样品进行 LC-MS 分析,包括蛋白质消化、色谱分离和质谱检测,使用特定软件进行数据处理和蛋白质鉴定。
- RT-qPCR(逆转录定量聚合酶链式反应):培养细菌,处理后提取 RNA,经 DNA 酶处理、逆转录得到 cDNA,进行 qPCR 反应,以 mreB 基因为内参,用 2???Ct方法计算基因相对表达量。
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