《mSphere 3.7》：Variable phylosymbiosis and cophylogeny patterns in wild fish gut microbiota of a large subtropical river
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这篇研究聚焦珠江 42 种野生鱼肠道微生物群，通过 16S rRNA 基因测序，发现鱼宿主特异性是肠道微生物群演化和多样化的关键驱动因素，地理、栖息地等因素也有重要影响，还揭示了共生模式，为理解野生鱼与微生物共生关系提供新视角。
研究背景
脊椎动物肠道存在多种微生物，尤其是共生细菌，共同构成复杂的微生物生态系统。肠道微生物群被视为动物重要的 “微生物器官”，与宿主诸多摄食特征紧密相关，进而影响种群增长、繁殖及营养生态位分化。鱼类是地球上种类最多样的脊椎动物，野生鱼肠道的细菌共生体对其生长、发育和健康意义重大。然而，相较于陆地生物，野生淡水鱼肠道微生物群的研究相对匮乏。
淡水鱼作为河湖中的主要消费者，因其多样的摄食模式，显著增强了水生栖息地的营养联系和营养物质循环 / 保留，常被视为维持河湖食物网稳定的关键物种。其营养摄取很大程度上依赖肠道微生物群，这些微生物能合成宿主必需的氨基酸、维生素和短链脂肪酸，调节肠道上皮细胞通透性，协助宿主降解植物多糖等营养物质，提高消化吸收效率，还能支持宿主调节能量代谢平衡、提升免疫功能和抵御病原体入侵。但宿主如何获取或继承这些关键共生体，从而维持相关益处，这一问题尚未得到充分解答。
珠江是中国第二大河流，位于热带和亚热带地区，拥有丰富的鱼类资源，目前已记录的淡水鱼超过 490 种。该流域的中、下游地区人口密集、经济活动活跃，受人类活动影响显著，水利工程建设改变了河流生态系统的环境因素，影响鱼类栖息地。在此背景下，探究环境和宿主因素如何塑造珠江野生鱼宿主 - 微生物的共生关系至关重要。本研究旨在通过对珠江中、下游 42 种野生鱼肠道微生物群的研究，揭示系统发育、环境和生物因素对其肠道微生物群的影响，明确微生物群落组装的生态过程，探索核心肠道微生物群的系统共生和共系统发育模式。
材料与方法
样本采集 ：2023 年 7 - 9 月，在珠江中、下游 11 个地点采集了 199 尾野生鱼，分属 42 种、14 个科。借助当地渔民，用刺网、笼子或延绳钓捕获完整的鱼。用 MS 222 麻醉后迅速断头，采集肠道组织及内容物样本，平均从采集到储存的时间控制在 10 分钟内，样本先存于液氮，回实验室后转移至 - 80°C 超低温冰箱保存。同时，记录鱼的分类信息、身体大小、性别、肠道特征（相对肠道长度）和饮食习惯（根据 FishBase 确定，包括食鱼性、食草性、食虫性、杂食性和食浮游生物性），并测定采样点的水温、溶解氧（DO）、总溶解性固体（TDS）电导率、pH、透明度（Secchi 深度，SD）、叶绿素 a（Chla）含量，以及氮（TN）和磷（TP）水平。DNA 提取、扩增和高通量测序 ：采用 QIAamp DNA Stool Mini 试剂盒从 0.2g 肠道内容物中提取总基因组 DNA。扩增 16S rRNA 基因的高变 V4 区（515F - 806R），用 1% 琼脂糖凝胶纯化 PCR 产物，Qubit 4.0 定量，然后将扩增子等量混合，在 Illumina PE 250 平台进行测序。序列数据处理 ：利用 QIIME2 环境分析 16S rRNA 基因序列。先根据条形码序列对原始数据进行分组，再用 Cutadapt 去除引物，DADA2 去除嵌合体序列。使用基于 SILVA（版本 138）16S 参考序列训练的 Na?ve Bayes 分类器对序列进行分类，排除未分类、标注为 “线粒体”“叶绿体”“古菌” 以及分类精度仅到域水平的序列。宿主系统发育树重建 ：从 NCBI 数据库检索与样本相关的细胞色素 c 氧化酶亚基 I（COI）基因序列，用 mafft version 7.310 进行比对，trimal version 1.4.rev15 微调，ModelFinder 确定最佳模型，用 iq - tree version 1.6.11 构建最大似然树，1000 次自展检验，在 ITOL version 6 展示。生物信息学分析 ：在 QIIME2 中计算 alpha 多样性指标（Faith’s PD 指数），绘制稀疏曲线评估测序深度。用 Kruskal - Wallis（KW）检验分析组间差异，Bonferroni 校正调整 P 值。使用 vegan R 包生成主坐标分析（PCoA）图，基于 Bray - Curtis 距离矩阵展示微生物群相似性；计算 Binary - Jaccard 和 Bray - Curtis 相异距离矩阵确定 beta 多样性，用 PERMANOVA 检验环境和宿主相关变量对细菌群落组成 beta 多样性距离的影响，用 betadisper 函数评估 β - 分散度。定义核心细菌分类群为在所有样本中出现率≥90% 且在每个鱼目出现率≥95% 的分类群。用 ParaFit 和 PACo（Procrustean Approach to Cophylogeny）评估宿主与共生体（核心属水平）的共进化关系，用 phylosignal R 包计算 ASV 的系统发育信号和局部系统发育关联指标（LIPA，local Moran’s I）。微生物群落组装和随机性 ：根据 Stegen 等人的方法，用包含 1000 次随机化的空模型计算 β - 最近分类单元指数（βNTI）和基于 Bray - Curtis 相异度的 Raup - Crick 指数（RCbray），判断群落组装过程是确定性（均质选择、异质选择）还是随机性（均质扩散、扩散限制、漂移）。
结果
肠道细菌组成 ：共获得 1554 万个 Illumina 序列，稀疏曲线显示多数样本测序深度足够。在目和科水平分别鉴定出 548 和 1022 种细菌。变形菌门（Proteobacteria）相对丰度最高，为 13.8% - 47.5%，其次是厚壁菌门（Firmicutes，8.4% - 49.9%）、梭杆菌门（Fusobacteria，0.83% - 34.8%）和拟杆菌门（Bacteroidota，2.3% - 17.1%），这四个门占所有鱼类物种总序列的 50% 以上。Cetobacterium 是最丰富的属，占总丰度的 11.75%，还有 Clostridium_sensu_stricto_1、Romboutsia、Aeromonas、Lactobacillus 和 Bacteroides 等属也较为丰富。共鉴定出 8 个核心细菌属，按相对丰度降序排列为：Cetobacterium、Clostridium_sensu_stricto_1、Aeromonas、Romboutsia、Bacteroides、Lactobacillus、Achromobacter 和 Bacillus，这些属在鲤形目（≥90.23%）、鲈形目（≥96.15%）和鲇形目（≥86.67%）中普遍存在且丰度较高。宿主因素塑造肠道微生物群多样性和群落结构 ：研究评估了宿主物种、地理位置、饮食、胃类型、栖息地类型和性别等因素对鱼肠道细菌群落 alpha 多样性（Faith’s PD）的影响。结果显示，不同物种、地理位置和栖息地类型的肠道细菌群落 Faith’s PD 值差异显著。PERMANOVA 分析表明，样本间的显著差异受多种因素不同程度影响，宿主物种对 Bray - Curtis（R2 = 33.6%）和 Binary - Jaccard（R2 = 25.9%）距离变化的解释比例最高。随着宿主分类阶元升高，样本属、科、目身份对 beta 距离变化的解释比例逐渐降低。PCoA 图显示同属和同种样本倾向于聚集在一起。
地理位置和栖息地类型对鱼肠道微生物群 beta 多样性也有重要影响，分别解释 8.0% - 11.8% 和 3.5% - 6.2% 的变异。方差分解发现环境和地理因素共同仅解释 1.49% 的变异，生态因素（3.7%）和地理因素（1.44%）单独解释率较低，溶解氧（DO）对微生物群落多样性的解释力最强，为 18.01%。Mantel 检验表明，在低破碎栖息地，DO 和 TDS 与鱼肠道细菌群落分类组成显著相关；在高破碎栖息地，pH 与分类组成相关性强。饮食、胃类型、肠道特征和性别等生物因素也解释了部分细菌变异性，其中肠道特征对不同样本 beta 距离变化的解释比例最高，且部分细菌门与宿主相对肠道长度存在相关性，如 Planctomycetota、Chloroflexi 和 Verrucomicrobiota 的相对丰度与相对肠道长度呈正相关，Bacteroidota 则呈负相关。3. 影响细菌群落组装的生态过程 ：量化了确定性（均质和异质选择）和随机性（均质扩散、扩散限制和漂移）过程对细菌群落组装的影响。结果显示，除鲱形目外，随机过程（扩散限制和漂移）在塑造所有宿主目细菌群落中起重要作用，鲱形目主要受确定性过程（异质选择）驱动。均质选择是大多数科群落组装的主要确定性过程，异质选择在鳀科（24.5%）、鲤科（3.0%）和鲿科（1.4%）样本微生物群落组装中起作用。漂移（20% - 77.7%）是随机过程中影响群落组装的最主要因素，均质扩散影响较小。生态过程的相对贡献在不同饮食、胃类型、栖息地和性别组中存在差异，低破碎栖息地鱼类宿主微生物群落受扩散限制的影响低于高破碎栖息地，且肠道微生物群相似性与 βNTI 呈负相关。4. 鱼类肠道微生物群系统共生的证据 ：计算宿主遗传相似性（基于 COI 基因序列）和微生物相异性（ASV 水平，基于 Bray - Curtis 距离），发现宿主 COI 基因相似性与肠道微生物相异性显著正相关。UPGMA 聚类树表明基于 Bray - Curtis 距离矩阵，不同宿主物种的细菌群落（属水平）相似性较高，鲤形目密切相关物种的肠道微生物群落相似性得到证实。β - 分散度分析显示宿主样本在物种水平的微生物群落组成异质性最低，表明肠道微生物群落组成与宿主物种水平密切相关。Venn 图显示不同目肠道样本有 18 个共享的 ASV，属于 Cetobacterium、Aeromonas 等属。
PACo 结果显示鲤形目宿主 - 微生物残差最低，鲱形目最高。对所有鱼类物种分析，Cetobacterium、Clostridium_sensu_stricto_1、Romboutsia 和 Bacteroides 这 4 个核心细菌属在两个共系统发育测试中有显著信号；对鲤形目、鲈形目和鲇形目分别测试，鲤形目与 Cetobacterium、Clostridium_sensu_stricto_1 和 Romboutsia 有共系统发育关系，鲈形目与 Cetobacterium 有共系统发育关系，鲇形目与 4 个核心属均无共系统发育信号。计算 LIPA 值发现，在宿主树中 97 个 ASV 有显著局部系统发育信号，主要集中在 Cetobacterium 和 Clostridium_sensu_stricto_1 等属，鲤形目宿主物种中 LIPA - ASV 平均数量高于其他目，且在鲤科（Cultrinae）分布集中，部分物种中 LIPA - ASV 分布广泛，如 Culter alburnus、Culter recurviceps 等。在鲈形目和鲇形目也发现了部分有强共系统发育信号的 LIPA - ASV。总体而言，ASV 特异性系统发育信号与鲤科物种显著相关，表明其在鲤科生态功能和演化中可能具有重要意义。
讨论
塑造淡水鱼肠道微生物群的因素 ：以往研究表明，海洋鱼类肠道微生物群多样性的主要驱动因素是摄食偏好而非宿主系统发育，栖息地环境和地理距离也有重要影响。但本研究发现，在珠江野生鱼中，宿主分类类别（物种水平）是肠道微生物群最强的预测因子，宿主遗传因素决定了部分细菌谱系的宿主特异性。虽然宿主栖息地的直接环境因素和饮食对微生物组成也有重要影响，但与以往研究认为鱼类肠道微生物群主要由栖息地决定的观点不一致，这可能是因为海洋和淡水栖息地差异显著，掩盖了宿主与肠道微生物系统的系统共生关系。此外，肠道特征（如相对肠道长度）与部分细菌门存在弱但显著的关联。淡水鱼肠道共生微生物群落的组装 ：本研究强调了随机过程（漂移和均质扩散）在珠江中、下游淡水鱼微生物群落组装中的重要作用，在鲤形目、鲇形目、鲈形目和合鳃目，随机过程的贡献超过确定性过程。但鲱形目受确定性过程（异质选择）影响较大，这可能与该目仅采集了一种鱼（Coilia grayii）且其具有特殊的洄游习性有关，在生殖洄游过程中经历淡水和咸淡水环境变化，导致肠道微生物群差异显著，异质选择使群落分化。不同鱼类家族肠道微生物群落组装过程差异明显，历史随机性因素的累积导致宿主遗传分化，进而驱动不同的宿主 - 细菌特异性。食浮游生物的鱼类肠道微生物组装相对更易受扩散限制影响，表明特殊饮食缩小了食物和觅食环境范围，限制了微生物的扩散。宿主生物因素（如胃的有无）也影响肠道细菌群落，且从低破碎栖息地到高破碎栖息地，扩散限制对细菌群落的影响增加，均质选择减少，这意味着不同环境选择压力导致鱼类肠道微生物群落差异显著，水利工程加剧的河流破碎化限制了鱼类肠道微生物的扩散。核心属 - 宿主系统共生和共系统发育模式 ：在脊椎动物和无脊椎动物中均证实了宿主 - 微生物群系统的系统共生关系，本研究也观察到显著的系统共生信号。系统共生的基础是群落中物种间微生物组相似性随宿主进化差异增加而降低，其原因包括宿主特异性过滤（如免疫水平、代谢系统、胃肠道微栖息地等与宿主系统发育相关的特征对肠道微生物群组装的影响）、微生物与宿主的共同进化历史，以及这两个因素的协同作用。
在本研究的物种系统发育树中，鲤形目系统共生信号最强，鲇形目、鲈形目等较弱，且在鲤形目物种中，ASV 特异性系统发育信号集中且与鲤科物种相关，符合脊椎动物肠道微生物组研究中系统发育信号在更细分类水平更强的观点。鱼类物种与部分核心细菌属（如 Cetobacterium、Clostridium_sensu_stricto_1、Romboutsia 和 Bacteroides）有强共系统发育信号，而 Aeromonas 虽为优势属但与宿主无共系统发育信号，不过其有较多 LIPA - ASV，这表明系统共生可能主要是生态或宿主生理过滤的结果，而非单纯的共进化。不同鱼类目在不同进化时间尺度上存在不同程度的共生，共生并非宿主 - 微生物群关系的普遍模式，在更细分类水平（如科或属），系统共生强度因多种因素（如饮食、栖息地偏好、地理位置、生活史和社会相互作用）的相对贡献差异而变化显著。
结论
本研究量化了中国大型亚热带河流中不同因素对鱼类宿主肠道细菌群落组装的相对贡献。研究结果表明，鱼宿主特异性是肠道微生物群演化和多样化的关键驱动因素之一，不同宿主分类水平对肠道微生物群变异的贡献程度不同。系统共生在全球和局部水平均明显，由生态或宿主生理过滤以及进化过程等复杂因素共同塑造。核心微生物群与不同分类群存在不同程度的共进化关系。基于研究结果推测，宿主遗传隔离或栖息地变化促进了异质选择（确定性过程），从而导致不同的宿主 - 核心微生物特异性。
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