《Scientific Reports》：Shifts in sex-specific immune gene expression in a beetle with parental care
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在自然界中，资源有限，动物繁殖时免疫功能与其他生理过程存在权衡。为探究性别角色与免疫基因表达的关联，研究人员以具有亲代抚育行为的 Lethrus apterus 甲虫为对象，通过多次采样和转录组分析。结果发现其免疫基因表达随季节变化，性别差异显著。该研究有助于理解生态免疫动态。
在自然界的生存竞争中，动物们面临着诸多挑战，其中如何平衡自身的免疫防御与繁殖需求，是一个至关重要的问题。免疫系统对于动物抵御病原体、维持生存起着关键作用，但维持和运行免疫系统需要消耗大量能量。在资源有限的情况下，免疫功能与其他生理和行为过程之间就会出现权衡。在有性繁殖的动物中，繁殖期是一个极为耗能的阶段，涉及产卵、育幼、防御等一系列活动，这些活动往往具有性别特异性，被称为性别角色。不同的性别角色意味着资源分配的差异，进而可能对两性的免疫活性产生不同影响。
以往在哺乳动物和鸟类中，已有不少研究证实了亲代抚育与免疫调节之间的关系。然而，在野生无脊椎动物领域，相关证据却相对匮乏。虽然已有少数研究发现无脊椎动物在繁殖过程中免疫功能会发生变化，但对于这些变化在繁殖季节内的发生频率，以及它们与具体性别角色之间的关联，仍然知之甚少。而且，传统检测免疫参数的方法存在局限性，难以深入了解昆虫免疫的全貌。因此，开展一项深入研究，全面揭示野生无脊椎动物在繁殖期内性别特异性免疫功能的变化规律，显得尤为迫切。
为了攻克这些难题，来自匈牙利德布勒森大学（University of Debrecen）、智利大学（Universidad de Las Américas 等多个研究机构的研究人员，选择了 Lethrus apterus 甲虫作为研究模型。这种甲虫具有明显的性二态性和明确的性别角色，繁殖季节短暂且活跃期特征明显，非常适合用于研究资源分配中的性别差异。
研究人员提出了三个假设：一是成年甲虫的免疫激活水平会随时间波动；二是由于雌性在产卵过程中消耗大量资源，其免疫相关基因的激活水平总体低于雄性；三是性别和采样日期之间存在显著的交互作用，预计在繁殖期后半段，性别角色差异最明显时，免疫基因表达的性别差异也最为显著 。
研究人员运用了多种关键技术方法。首先是样本采集，在 2019 年春季，于匈牙利苏萨村附近的甲虫密集种群中，选取 5 个时间点，每次采集 4 只雄性和 4 只雌性甲虫，共获得 40 个样本。采集时记录甲虫的性别和活动状态，并提取头部组织用于后续实验。其次是 RNA 提取和测序，利用 TRI Reagent Solution 提取总 RNA，经检测后构建 cDNA 文库，在 Illumina HiSeq 4000 平台进行测序。然后是转录组组装和功能注释，通过一系列软件对原始测序数据进行处理，预测潜在的开放阅读框，并进行功能注释，筛选出免疫相关基因。最后是差异表达基因分析，使用 DESeq2 等软件对免疫和抗菌肽（AMP）基因进行差异表达分析，并通过主成分分析（PCA）等方法探究样本的表达变化。
研究结果如下：
转录组组装和免疫相关基因预测 ：研究人员识别出 10 个编码 AMP 的基因（共 19 个转录本），结合基因本体（GO）注释，确定了 296 个在甲虫活跃期表达的免疫相关基因（880 个转录本）。差异基因表达分析 ：
性别和采样日期对免疫基因表达谱的总体影响 ：PCA 分析显示，非 AMP 基因可分为两组，一组为首次采样样本，另一组包含其他采样日期样本；AMP 基因则未呈现出与采样日期相关的明显分组。在 5 月 2 日（第四次采样），非 AMP 和 AMP 基因均出现显著聚类，此时雄性和雌性样本分别聚类，表明该时期存在大量差异表达基因。性别特异性免疫基因表达 ：综合所有采样日期，两性之间有 24 个免疫基因表达水平存在显著差异，但差异基因数量未达到统计学显著水平。分采样日期来看，性别差异表达基因数量在各采样日期有所不同，5 月 2 日差异最大。此外，只有少数特定基因在多个采样日期反复上调或下调。免疫基因表达谱的季节性变化 ：采样日期对甲虫免疫基因表达有显著影响。分别对雌性和雄性进行分析，发现与首次采样相比，雌性有 142 个基因、雄性有 137 个基因表达发生变化，并分别聚类为 13 个和 11 个簇。若仅考虑两性共有的差异表达基因，则有 88 个基因，分为 8 个表达簇。将所有至少在某一性别中差异表达的基因聚类，形成 16 个簇。活跃期内免疫基因表达的性别特异性变化 ：以首次采样为参照，性别和采样日期的交互作用模型显示，有 29 个免疫基因在活跃期内呈现性别特异性表达变化，这些基因分为 6 个簇，多数簇在 4 月 19 日或 5 月 2 日性别差异最大，其中 3 个基因为 AMP。
研究结论和讨论部分表明，该研究全面刻画了 Lethrus apterus 甲虫活跃期内性别特异性免疫变化的动态过程。免疫基因激活是一个动态过程，受多种因素影响，虽然无法确定寄生虫感染情况，但研究结果可能代表了甲虫免疫激活的基线水平。甲虫活跃期内免疫基因表达的差异，很大程度上可能归因于其承担的性别角色。在繁殖过程中，昆虫可能会暂时抑制免疫能力，以分配资源用于繁殖投资。
研究还发现，总体上雄性免疫相关基因上调略占优势，但差异不显著，这可能是因为两性在繁殖期的总投资相当。此外，特定日期免疫基因表达的性别差异明显，如 5 月 2 日，雌性 AMP 编码基因显著下调，此时雌性忙于收集树叶，而雄性负责守卫洞穴，这种行为差异可能介导了免疫基因表达的性别差异。
这项研究成果发表在《Scientific Reports》上，具有重要意义。它为理解野生无脊椎动物在繁殖期的免疫调节机制提供了新的视角，揭示了性别角色与免疫基因表达之间的复杂关系。同时，强调了连续采样方案对于研究野外生态动态的重要性，为后续相关研究提供了方法学参考。未来研究可以进一步控制环境因素和生物因素，深入探究甲虫特定行为对免疫活性的影响，以及两性繁殖的免疫成本，从而更全面地揭示动物免疫与繁殖之间的权衡奥秘。
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