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基于SYBR? Green的快速RT-qPCR技术首次在厄瓜多尔腹泻病雏鸡中检出鸡星状病毒(CAstV)及其分子特征分析
《BMC Veterinary Research》:First report of molecular detection of chicken astrovirus (CAstV) in chicks affected with enteric disease in Ecuador through a fast RT-qPCR assay based on SYBR? Green
【字体: 大 中 小 】 时间:2025年04月01日 来源:BMC Veterinary Research 2.3
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为解决鸡星状病毒(CAstV)在厄瓜多尔家禽业中的诊断空白问题,厄瓜多尔拉斯美洲大学团队开发了基于SYBR? Green的快速RT-qPCR检测技术。研究对120例7日龄腹泻雏鸡空肠样本进行检测,发现70.83%样本携带高浓度CAstV(最高达9.6×107拷贝数),首次证实CAstV在厄瓜多尔的存在。该检测方法灵敏度达101拷贝/μL,耗时仅1.5小时,为禽类肠道疾病提供了经济高效的诊断方案,对控制垂直传播和制定生物安全措施具有重要意义。
针对这一双重挑战,厄瓜多尔拉斯美洲大学联合圣保罗大学的研究团队开展了一项突破性研究。研究人员收集了来自皮钦查州6个养殖场的120例7日龄腹泻死亡雏鸡空肠样本,这些病例均表现出典型RSS症状:嗜睡、腹泻、泄殖腔黏连,剖检可见肠壁变薄、充满黄绿色液体和气体。通过创新设计靶向ORF1b基因(编码RNA依赖的RNA聚合酶)的引物,团队建立了SYBR? Green荧光定量RT-qPCR检测体系,在《BMC Veterinary Research》发表了首个厄瓜多尔CAstV分子流行病学研究。
关键技术方法包括:采用TRIzol法提取空肠组织RNA,随机引物和oligo dT引导逆转录;基于ORF1b基因序列(GenBank OQ685946.1)设计引物CASTV-F/R,扩增长度74bp;构建108-101拷贝的质粒标准曲线;通过熔解曲线(单一峰77.5°C)和交叉反应实验验证特异性;随机选择阳性样本进行Sanger测序和系统发育分析。
研究结果方面,"宏观病变"部分揭示所有病例均出现肠管扩张、卵黄残留,但肝脏、肾脏等未见病变,提示CAstV可能与其他肠道病原体共同致病。"引物设计"显示成功扩增ORF1b基因保守区。"标准曲线"验证该方法效率达97.3%,检测限低至101拷贝/μL。"重复性分析"显示批间变异系数仅0.126-0.334%。"检测定量"部分显示85例(70.83%)阳性,病毒载量跨度达10-9.6×107拷贝/毫克组织,呈现明显剂量异质性。"系统发育分析"发现厄瓜多尔毒株与印度、巴西株核苷酸相似度83.27-93.5%,形成独立进化支(自举值94%),与中国株相似度仅34.7-37.9%。
讨论部分强调三个关键发现:首先,70.8%的7日龄雏鸡阳性率强烈暗示垂直传播的存在,这与Smyth等报道的>105.99拷贝高病毒载量致生长障碍的结论相符。其次,该方法较传统PCR缩短50%耗时(1.5小时),且成本仅为水解探针法的1/3,为资源有限地区提供实用工具。最后,29.17%阴性样本提示需进一步筛查鸡细小病毒(ChPV)、禽腺病毒(FAdV)等共感染病原体。
这项研究不仅填补了厄瓜多尔CAstV分子流行病学空白,其建立的快速诊断体系更具备三大应用价值:为养殖场提供早期预警工具,助力区分疫苗免疫与野毒感染;通过病毒载量监测评估垂直传播风险;基于ORF1b基因的保守性设计确保对变异毒株的检测稳定性。未来研究需扩大采样范围以确定CAstV基因型与临床症状的关联,并探索与其他肠道病毒的协同致病机制。该成果为南美地区禽病防控提供了重要技术支撑和理论依据。
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